Shewanella piezotolerans WP3中sulfotransferase基因的克隆表達與活性研究

韋海瀾,李艷霞,李升康

(1.汕頭大學生物系,廣東 汕頭 515063;2.汕頭大學海洋生物研究所,廣東 汕頭 515063)

0前言

磺基轉移酶(sulfotransferase,簡稱ST)可以催化硫酸基從供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate,簡稱PAPS)轉移至如糖類、蛋白質和各類小分子新陳代謝產物[1-2].磺基轉移酶是一個基因超家族,包括酚磺基轉移酶、雌激素磺基轉移酶、羥基類固醇磺基轉移酶以及脫水表雄甾酮磺基轉移酶等[3-4].磺基轉移酶在動植物及微生物中均有發現[5],但目前對于這類酶的研究主要集中在真核生物[6-7].根據胞內分布和作用底物,真核生物的磺基轉移酶被分為兩大類別:酚(SULT1)和羥類固醇(SULT2)兩大亞族.胞質溶膠的ST可將硫酸基轉移至類固醇和其他疏水性的代謝產物上,而高爾基體中的ST則可以硫酸化細胞膜上的糖類和分泌蛋白.相比之下,對細菌ST的分布和功能以及其產物的研究則比較少.

本文以從西太平洋的深海沉積物中分離得到的耐冷耐壓菌株WP3為研究材料[8-9],通過克隆表達其磺基轉移酶基因并分離異源表達蛋白,以期為后續實驗的WP3胞外寡糖的離體(in vitro)硫酸化修飾工作奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

菌株WP3為國家海洋局第三海洋研究所海洋遺傳資源重點實驗室惠贈.大腸埃希菌(E.coli)Top10和BL21(DE3)由汕頭大學微生物實驗室提供.

1.1.2 試劑

表達載體pQE-30、pQE-70基因組DNA提取試劑盒購于德國Qiagen公司.PCR擴增所用的引物由上海生物工程公司合成,DNA凝膠回收試劑盒以及質粒小量提取試劑盒均購于美國OMEGA公司.克隆載體pMD19-T、Ex-Taq DNA聚合酶、限制性內切酶BamHⅠ和HindIII、T4 DNA連接酶以及DL2000 DNA Marker均購于寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa).Ni-NTA matrix及柱子購于英國Amersham Pharmacia公司,蛋白凝膠電泳染色和脫色采用廈門鷺隆生物公司的蛋白染色試劑盒.

1.2 方法

1.2.1 引物的設計合成

根據GenBank進行同源性搜索,設計了兩對sulfotransferase引物.利用GeneTool軟件設計并合成特異性引物(由上海生物工程公司合成):PCR引物設計用DNAstar,基因Swp1579的引物序列為:上游引物Swp1579-F:5'GCGT GCA TGC AAT TGT TTT TAT ATA TCA 3'引入SphⅠ酶切位點(下劃線部分);下游引物Swp1579-R:5'GCGCG AAG CTT CTA CTC TAT AAT CGG TTT 3'引入HindⅢ酶切位點(下劃線部分).基因Swp4147的引物序列為:上游引物Swp4147-F:5'ACAT GCA TGC GA AAA AAG ACA ATT TTA G 3'引入SphⅠ酶切位點(下劃線部分);下游引物Swp4147-R:5'GGA AGA TCT TTT GCT GAA TAG CTT CTG A 3'引入BglⅡ酶切位點(下劃線部分).

1.2.2 WP3 DNA提取和PCR擴增

WP3使用2216E培養基,于20℃條件下培養,液體培養基設定搖床轉速為150 r/min.DNA提取采用酚氯仿抽提方法,用20 μL滅菌雙蒸水或者50 μL 10 mM TE緩沖液溶解沉淀,經分光光度計檢測合格后-80℃保存.采用Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增,PCR反應反應程序為:95℃ 3 min,95℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 2 min以上,3步循環30次,72℃ 10 min.電泳檢測PCR產物,并割膠回收.

1.2.3 PCR產物的克隆和測序

采用E.Z.N.A.TMPlasmid Mini KitⅠ柱式質粒提取試劑盒(Omega公司).利用T4 DNA連接酶將回收純化的PCR產物與pMD19-T載體進行連接,連接產物轉入經CaCl2處理的感受態細胞即E.coli Top 10克隆菌中.通過含氨芐青霉素抗性(Ampr)的LB平板進行抗氨芐篩選,挑取陽性菌落(含重組質粒)進行擴增提取質粒,并對質粒進行雙酶切鑒定,pQE-30質粒采用PaeⅠ(SphⅠ)和HindⅢ限制性內切酶進行酶切反應,pQE-70質粒采用PaeⅠ(SphⅠ)和BglⅡ限制性內切酶進行酶切反應.對雙酶切合理的質粒進行測序(由深圳華大基因完成)驗證.

1.2.4 表達載體的構建以及測序

對測序正確的pMD19-T質粒與原核表達載體pET-32a(+)分別進行BamHⅠ和Hind III雙酶切,并將獲得的目的基因片段和切開的pET-32a(+)載體進行膠回收.利用T4 DNA連接酶16℃過夜酶連.將重組質粒轉化入E.coliTop10,通過含氨芐青霉素抗性(Ampr)的LB平板進行抗氨芐篩選.提取陽性質粒并測序鑒定.

1.2.5 重組目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表達

將重組表達載體轉化到E.coli BL21(DE3)中,陽性菌落于20 mL LB培養基中,37℃ 160 r/min過夜培養.次日轉接至500 mL滅菌的新鮮的培養基中,再加入500 μL氨芐青霉素進行培養.待菌液OD595值為0.5~0.6時,取1 mL菌液作為誘導前的對照,其余菌液加入500 μL IPTG 25℃低溫誘導4 h.誘導后取1 mL菌液作為誘導后的對照,分別將誘導前、誘導后的菌液離心,并分別用1 mL去離子水清洗,用80 μL純凈水重懸菌體.將上述誘導后的菌液離心、棄上清,沉淀用Tris-HCl(pH8.0)溶解,溶解后超聲破碎30 min后離心.將沉淀和上清分裝:沉淀先用1 mL去離子水清洗,離心棄上清,用80 μL去離子水重懸.取上清80 μL.然后將誘導前、誘導后的上清和沉淀80 μL分別加入20 μL Loading Buffer,進行蛋白凝膠SDS-PAGE.電泳檢測表達情況,以確定其表達產物的可溶性.蛋白凝膠電泳參照《分子克隆實驗指導》(第二版).

1.2.6 重組目的蛋白的純化及濃度測定

采用Ni2+親和層析法純化目的蛋白.上樣用平衡液(20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 8.0)平衡柱子,分別用40,100,300 mmol/L的咪唑進行洗脫,分別收取洗脫峰液.SDS-PAGE檢測純化結果.采用TIANGEN公司的蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度.

1.2.7 磺基轉移酶活性測定

磺基轉移酶活性測定依照文獻進行[10].化學反應為PAP+PNS→PN+PAPS,反應通過磺基轉移酶ST實現.通過檢測405 nm的吸光值來檢測PN的生成量,PN的特定吸收峰在405 nm.通過PNS底物不同的添加量分析酶的活力情況.分析溶液:50 mmol/L PNS 30 μL,20 mmol/L PAP(磺基受體)290 μL,0.1 mmol/L Tris-HCl,pH8.0 210 μL,酶溶液100 μL,總體積630 μL.測量其于37℃下間隔5 min的405 nm吸光值,加入400 μL 1mol/L NaOH終止反應.

2 結果

2.1 WP3磺基轉移酶基因的克隆和原核表達載體的構建

以S.piezotolerans WP3基因組為模板,用根據WP3基因組中含有的兩個磺基轉移酶基因設計的兩對引物進行PCR擴增,均得到了特異的擴增條帶,分別在900 bp和1700 bp左右,與預期相符(圖1).PCR產物回收后雙酶切,經膠回收后連入同樣經雙酶切的兩對載體,轉化E.coli,用PCR擴增引物進行菌落PCR挑選陽性克隆子并測序.

圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 WP3磺基轉移酶的表達和純化

全長849 bp的WP3磺基轉移酶基因Swp1579和1707 bp的Swp4147基因分別被克隆到表達載體pQE-30和pQE-70上,在E.coli BL21(DE3)菌株中使用0.5mmol/L IPTG誘導表達,誘導前后的菌

體使用超聲波破碎后取菌體總蛋白使用SDS-PAGE分析,可見在分子量約33KDa和60KDa處分別有明顯增大的條帶,并且Swp4147基因的重組蛋白表達量(圖3)要多于Swp1579(圖2).

圖2 Swp1579基因在E.coli BL21(DE3)中表達蛋白的SDS-PAGE分析結果

圖3 Swp4147基因在E.coli BL21(DE3)中表達蛋白的SDS-PAGE分析結果

2.3 磺基轉移酶活性測定

根據磺基轉移酶在405 nm的吸光值檢測到的PN得率,計算其酶活變化.其酶活變化見圖4.由圖4可知,本實驗在E.coli表達的sulfotransferase rST均有酶活性.相對而言,重組的Swp4147的酶活稍強于Swp1579.

圖4 轉磺酶酶活檢測

3 討論

為了使目的基因的克隆得到充分的表達,我們在上游的實驗設計中即選擇了含有強力啟動子的表達載體和高效表達宿主.試驗結果表明,在IPTG誘導下,誘導溫度為37℃時,兩個基因的克隆子在表達宿主中均有表達重組磺基轉移酶(rST),其中Swp4147基因克隆的重組蛋白表達水平較高.為了提高表達產物的可溶性,需要對溫度和IPTG誘導濃度兩方面條件進行優化.一般來說降低細菌的培養溫度將降低外源基因的轉錄速度,減慢外源蛋白的合成速率,因而有利于外源蛋白的正確折疊,增加具有活性的可溶性蛋白產量.同時,WP3是一個低溫菌[9],考慮使用低溫誘導符合這一蛋白的原始表達折疊狀態.

硫酸化多糖是一類非常常見的生物活性多糖(biologically active polysaccharides,BAP),而且因其具有很好的生物學活性近年來備受關注[11-12],硫酸化多糖是多糖的衍生物,由多糖鏈單糖分子上的某些羥基被硫酸根取代而形成.磺基轉移酶在多糖的硫酸化修飾中起到了非常重要的作用[13].研究表明,海藻中的硫酸多糖,發現其具有體內抗腫瘤作用[14];美國國家癌癥研究所對海洋無脊椎動物篩選發現,其水相提取物顯示出較強的抗病毒活性,這些活性組分基本是硫酸多糖[15].另有研究也表明,有些本身不表現抗病毒活性的多糖,經人工化學修飾硫酸化后也具有抗病毒活性;而有抗病毒活性的硫酸多糖被脫去硫酸根后,即失去抗病毒活性.例如,卡拉膠和肝素等具有抑制皰疹病毒復制的作用[12],但是如果將這些多糖的硫酸根除去,上述活性則隨之消失.

微生物多糖在工業和日常生活方面具有很多的應用價值,比如工業用的絮凝劑,食品用的保鮮劑,醫藥用的抗癌劑等等[16].目前,微生物中多糖的修飾包括硫酸化多糖的研究很不多,但是已有研究顯示修飾多糖對微生物多糖的活性起了重要的作用.我們通過體外異源的表達表明,WP3中存在很強的磺基轉移酶活性,且該酶的相關基因在WP3中存在多拷貝.

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