原位末端標記法檢測齊墩果酸誘導細胞凋亡的實驗研究

董靜，李明珠，畢克濱，吳勃巖

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

全球每年患惡性腫瘤的人數達到1 200多萬，據此估計至2020年全球腫瘤的發病率將上升50%。癌癥已成為威脅人類健康的第一致死疾病。近年來中藥有效成分在抗腫瘤方面的研究，主要是從中藥有效成分誘導細胞凋亡的抗腫瘤機制入手。齊墩果酸(oleanlic acid，OA)，又名慶四素，屬五環三萜類化合物，是廣泛存在于自然界中的天然有效成分，在許多植物中含量豐富，如女貞子、山楂、白花蛇舌草、大棗、丁香等［1］。藥理研究證實，齊墩果酸具有護肝解毒、降脂降糖、抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化的作用，還具有提高機體免疫功能的作用［2］。本實驗采用原位末端標記的方法，研究齊墩果酸對荷瘤小鼠腫瘤組織中細胞凋亡的影響，通過對凋亡指數的分析，探討齊墩果酸誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，體質量18～22g，雌雄各半，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 瘤株、藥物和試劑

小鼠S180腹水瘤株(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院);齊墩果酸(珠海潤都制藥有限公司);環磷酰胺(CTX，上海華聯制藥有限公司);TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 實驗方法

2.1 S180肉瘤腫瘤模型的建立

取18～22g昆明種小鼠50只，將S180瘤株用生理鹽水1∶3稀釋，以0.2ml每只接種于小鼠右前腋下，制備小鼠實體瘤模型。

2.2 TUNEL 法檢測

取接種S180瘤株的小鼠隨機分為生理鹽水(模型)組，環磷酰胺(CTX)組，齊墩果酸高、中、低劑量組。于接種S180腫瘤細胞6h后首次給藥，齊墩果酸高、中、低劑量組分別按 4.992mg/kg、2.496mg/kg 和 1.248mg/kg灌服給藥，每日1次。CTX組按40mg/kg腹腔注射給藥，每日1次。模型組用生理鹽水以0.2ml/只灌服，每日1次。連續給藥8天后處死小鼠，剝離腫瘤組織，用福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，經HE染色后進行原位末端標記實驗。采用原位細胞凋亡檢測試劑盒，按說明書操作。經TUNEL試劑盒染色，細胞核內出現棕黃色的為凋亡細胞(陽性細胞)，計算凋亡指數(apoptosis index，AI)，即每張TUNEL切片選取5個陽性細胞數最多的高倍鏡視野，每個視野計算100個腫瘤細胞，計算陽性細胞數與總細胞數的百分比［3］。

2.3 統計學處理

3 結果

齊墩果酸對S180荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響，經原位末端標記法(TUNEL法)凋亡染色，細胞核呈現出棕黃色或者棕褐色染色的細胞為陽性細胞，細胞核藍染的細胞是蘇木素復染的陰性細胞。在10×40高倍鏡下，選取5個陽性細胞數最多的高倍鏡視野，每個視野計算100個腫瘤細胞精確選取其中的陽性細胞，對S180荷瘤小鼠腫瘤組織中各組細胞凋亡指數進行分析。結果見表1，與生理鹽水(模型)組比較，齊墩果酸高、中、低組細胞凋亡指數明顯上升(P＜0.01)，差異顯著，具有統計學意義。

表1 齊墩果酸對S180荷瘤小鼠細胞凋亡的影響(±s)

表1 齊墩果酸對S180荷瘤小鼠細胞凋亡的影響(±s)

注:與模型組相比，＊＊P＜0.01。

組別 給藥量(mg/ml) n 細胞凋亡指數(%)模型組 —10 4.3 ±1.494 43 CTX 組 40 10 15.4 ±1.505 55＊＊OA 高組 4.992 10 14.8 ±1.316 56＊＊OA 中組 2.496 10 14.4 ±1.074 97＊＊OA 低組 1.248 10 12.8 ±1.229 27＊＊

4 討論

細胞凋亡是一種在形態學上區別于細胞壞死的程序性的死亡形式，在細胞接受特定的信號下，由凋亡相關基因控制的主動的細胞自我清除過程。從細胞凋亡角度分析，腫瘤形成是由于細胞增殖的數目大于細胞的死亡數目，使細胞總數不斷地增加所致。所以，細胞的增殖和細胞凋亡的不平衡與腫瘤的形成和發展有關。細胞凋亡是治療腫瘤的主要途徑之一，凋亡細胞中的內源性核酸內切酶被激活后，DNA被切割成了許多雙鏈DNA片段和高分子量單鏈DNA斷裂點(缺口)，從而暴露出了大量的3－羥基末端。TUNEL法是標記的脫氧核苷酸(通常為dUTP)被末端轉移酶TdT轉移到DNA缺口或者3－羥基的末端上的一種方法。標記后的樣品與相應的酶聯抗體作用后可產生顏色反應，原位特異性的顯示出凋亡細胞。主要采用的是熒光標記法與酶標記法，顯微鏡下觀察［4］。本實驗采用了TUNEL法觀察細胞凋亡的情況，結合陽性的棕黃色細胞與HE染色，觀察細胞凋亡的表現，從形態學上證實齊墩果酸具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。齊墩果酸對誘導腫瘤細胞凋亡的作用是多因素的復雜的生物學過程，誘導腫瘤細胞凋亡的具體機制還有待研究。本實驗為臨床上研究低毒、有效的抗癌藥物奠定實驗基礎和提供科學數據。

［1］李旸，劉卓剛，吳斌.齊墩果酸抗腫瘤作用機制［J］.實用醫學雜志，2010，26(20):3830 －3832.

［2］李欣，王艷宏，呂邵娃，等.齊墩果酸納米脂質載體的制備及性質表征［J］.中醫藥學報，2013，41(1):59 －62.

［3］鄭國燦.牛蒡子苷誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的實驗研究［J］.中國病理生理雜志，2008，24(3):586 －587.

［4］何雯，張蓓，劉無逸.四種細胞凋亡檢測方法的比較［J］.中外醫療，2007，27(24):1－2.