芹菜籽中黃酮成分的提取純化及LC-MS檢測

姜笑寒 孟 青 劉莉蘭 劉紅梅

1.廣東省食品藥品職業技術學校，廣東廣州 510663；2.廣東藥學院 中心實驗室，廣東廣州 510224

旱芹（Apium Graveolens，celery）為傘形科一年生或二年生草本植物，異名香芹、藥芹等[1]。芹菜籽為傘形科植物旱芹Apium graveoleus L.var.dulce DC.的干燥成熟果實。目前研究表明芹菜籽具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等多種藥理活性[2]。芹菜籽主要含有揮發油成分、苯酞類衍生物、香豆精類成分、黃酮及其甙類成分[3]。其中黃酮類成分主要有3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙[4]。本試實驗采用醇提取的方法對去油后芹菜籽中的黃酮成分進行提取，大孔樹脂和聚酰胺柱分離純化提取物，得到三個含黃酮成分的洗脫液，采用LC-MS法對其進行了檢測，推測40%乙醇洗脫液含有的主要成分為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器

提取罐（弘荃機械企業有限公司）；KQ-400DB型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雙口4列電熱恒溫水浴鍋（江西新建醫療器械廠）；電子天平（sartotius德國產）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）；DRT-SX型恒溫電熱套（鄭州長城科工貿有限公司）；RE-52旋轉式蒸發器（上海亞榮深化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Waters 2695－2487 HPLC（Waters公司）；LCQ DECA XP液質聯用儀（美國Thremo公司）。

1.2 試劑與藥材

乙醇（天津富宇精細化工有限公司）；甲酸（廣州市東紅化工廠）；磷酸（色譜醇）（天津市科密歐化學試劑開發中心）；甲醇（色譜醇）、乙腈（色譜醇），（Tedia Company Inc.USA）；蒸餾水、二次去離子水（實驗室自制）；大孔吸附樹脂D-16（中國滄州遠威化工有限公司）；80～100目聚酰胺樹脂（浙江臺州路橋四甲生化塑料廠）；芹菜籽（廣東澄海明豐種子有限公司）。

2 方法與結果

2.1 制備芹菜籽黃酮

超臨界萃取后的芹菜籽，取5 kg，加80%乙醇于提取罐中80℃回流提取3次，每次加80%乙醇10倍量，提取1 h。合并三次提取液，提取液旋轉蒸發，回收乙醇，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到粗提物，出膏率為14.6%。

2.2 大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂純化[5-6]

填裝大孔樹脂 D-16柱子，活化處理好后，濕法上樣粗提物，依次用水，10%乙醇，20%乙醇洗脫，40%乙醇，60%乙醇，95%乙醇洗脫完全，收集各洗脫液，旋轉蒸發，回收乙醇，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到初級純化部分。填裝聚酰胺柱，處理后取40%乙醇、60%乙醇洗脫液的初級純化部分，拌樣上聚酰胺柱，依次用水，40%乙醇洗脫，收40%洗脫液，旋轉蒸發，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到純化部分。

2.3 LC檢測

2.3.1 液相色譜條件 色譜柱為：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱溫30℃；流動相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；檢測波長：340 nm；記錄時間：45 min。

2.3.2 檢測 將純化后的提取物用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，過0.2微孔濾膜后LC分析，得到純化后的芹菜籽黃酮色譜圖（圖1）。

2.4 LC．MS檢測

2.4.1 色譜條件 色譜柱為：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱溫30℃；流動相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；檢測波長：340 nm；記錄時間：45 min。

2.4.2 質譜條件 離子化方式ESI（負離子方式）；掃描范圍：m/z200～800；干燥氣流10 mL/min；干燥器溫度：350℃；霧化氣壓：310kPa；毛細管電壓3500V；碎裂器電壓：70V。

2.4.3 檢測 對純化后的芹菜籽黃酮處理（處理方法同2.3.2），進行LC－MS分析，并對 40%乙醇洗脫部分1，2，3峰進行了成分推測（表1）。

3 討論

①考察提取方法時，根據文獻[7-8]先采用了單因素實驗確定了乙醇濃度和提取溫度，然后通過正交實驗考察提取時間、提取次數和料液比對黃酮提取率的影響。確定提取工藝即十倍溶劑量提取三次，每次提取3 h。考慮到時間影響因素對黃酮提取率最弱，再加上經濟因素，最終確定提取工藝：80%乙醇溶液，80℃的條件下，以10倍溶劑量，提取3次，每次1 h。

②采用 LC－MS分析時，因為黃酮結構中含有較多的酚羥基，呈現弱酸性，易失去H，所 以選取了電噴霧負離子模式（ESI），形成 [M－H]－離子，通過碎片及分子量初步推斷，三類黃酮苷類化合物所帶糖基基本一致，均為一個木糖和一個葡萄糖。結果顯示（見表1）：保留時間為27.60 min的化合物，其[M—H]一質荷比（m/e）為579，有285和447碎片峰，推測其為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙；保留時間為46.1 min的化合物，其[M－H]－質荷比（m/e）為564，有431和269碎片峰，推測其為芹菜甙；保留時間為53.7 min的化合物，其[M－H]－質荷比（m/e）為594，有299和461碎片峰，推測其為3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

圖1 純化后的芹菜籽黃酮色譜圖

表1 40%乙醇洗脫部分 1，2，3峰成分推測

4 結論

本實驗采用醇提法提取去油后芹菜籽中的黃酮成分，大孔樹脂和聚酰胺進行分離純化 ，液相色譜．質譜聯用法檢測到黃酮成分主要在40%乙醇洗脫部分，并對40%乙醇洗 脫部分成分進行了推測，推測其含有的主要成分為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。結果說明此提取純化方法具有可行性。

[1] 劉詠松.芹菜的本草研究及功用[J].四川中醫，2004，22（7）：25-26.

[2] 王文寶，馬華夏，宋春梅.芹菜籽化學成分及藥理作用的研究進展[J].吉林醫藥學院學報，2012，33（1）：49-51.

[3] 呂金良，牟新利，王武寶，等.近年來維藥芹菜籽揮發油化學成分研究[J].時珍國醫國藥，2006，17（1）：6-7.

[4] 上海中醫藥大學.中藥大辭典（上）[M].2版.上海：上海科技出版社，1997.

[5] 謝遠紅.大孔吸附樹脂純化芹菜黃酮的研究[J].廣東化工，2012，39（5）：30-31.

[6] 嚴志慧，陳亮，羅軍武，等.聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J].湖南農業科學，2009（1）：85-88.

[7] 張洪杰，李小吉.芹菜葉中黃酮類化合物的提取浴測定[J].廣東化工，2011，38（1）：201-203.

[8] 謝遠紅.芹菜總黃酮提取工藝研究[J].江蘇農業科學，2012，40（9）：256-258.