枯草芽孢桿菌BS-2018在海參養殖中的應用效果

薛德林 呂盛福 胡江春 孫向陽 王書錦

(1 中國科學院沈陽應用生態研究所 沈陽 110016 2 大連翔華生物飼料有限公司 大連 116222)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是能夠產生芽孢的兼性好氧微生物。在分類學上屬原核生物、真細菌[1]。主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中[2，3]。由于枯草芽孢桿菌具有生物好氧、調整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，使其在提高動物機體免疫力、增強消化系統酶活性、防病治病和促進生長中起著重要作用[4]。枯草芽孢桿菌菌體繁殖速度快、容易培養，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸，其芽孢抗逆性強、耐高溫、耐酸堿、耐擠壓，產品適用范圍廣泛等特點，并且它能作為模式菌株在生物芯片上進行有效的DNA擴增和蛋白質、氨基酸分離[5，6]。國內外許多學者研究表明，枯草芽孢桿菌在醫藥保健、水產養殖、禽畜養殖和生態環保等方面均有較高的研究價值和應用價值[7]。因此，枯草芽孢桿菌愈來愈引起科技工作者和企業界人士的重視[2，4，8～12]。

腐植酸鈉是堿性的有機大分子聚合物，分子中含有苯環和吲哚等，功能基團有羥基、酚羥基、甲氧基等，在海參養殖中的應用主要是利用這些活性基團，吸附水域環境中的有毒有害物質，凈化養殖環境。腐植酸鈉作為營養物質，含有的蛋白質、氨基酸、有機鈣、微量元素、抗病因子等生物活性物質，有利于營養物質的轉化吸收和新陳代謝，可以減少腸道疾病的發生，近年來，在海參養殖中已有應用[3，10]。

現將枯草芽孢桿菌BS-2018菌株和腐植酸鈉在海參育苗和養殖中的試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌B S-2 0 1 8菌株，從東經122°21′，北緯39°34′的遼寧大連黃海海域的10 m深海底的底泥中分離得到。

1.1.1 培養基與培養條件

斜面種子培養基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉1 g、硫酸鎂5 g、磷酸氫二鉀1 g、純凈水定容至1000 mL、pH值7.0～7.2、瓊脂20 g。

滅菌條件：0.08 MPa、115 ℃滅菌、18 min；培養溫度：30 ℃，培養箱靜止培養48 h。

液體種子培養基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g、玉米面10 g、豆粕10 g、硫酸銨1 g、氯化鈉1 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、純凈水定容至1000 mL、pH值7.0～7.2。

500 mL三角瓶裝液量為200 mL，接種量5%，滅菌條件：0.1 MPa、121 ℃滅菌、18 min；培養溫度：30 ℃，轉數180 rpm、搖床培養培養36 h。

1.1.2 發酵罐培養基與發酵培養條件

發酵罐培養基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、玉米面1.0%、豆粕1.0%、硫酸銨0.1%、氯化鈉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.10%、pH值7.0～7.2。

發酵罐裝液量為70%，接種量5%，滅菌條件：0.08 MPa、121 ℃、20 min;

發酵罐培養條件：發酵時罐內壓強0.03～0.05 MPa、培養溫度30 ℃、轉速180 rpm、無菌風量100～120 vvm、時間為48 h。

1.2 供試腐植酸鈉

腐植酸鈉含量≥55.0%，其他成分≥5.0%，新疆雙龍腐植酸有限公司，市售。

1.3 供試海參

遼寧海刺參(Apostichopus Japonicus)，遼寧省大連渤海海珍品科技公司，自繁。

1.4 試驗布置

1.4.1 海參浮游期、稚幼參期、越冬保苗期試驗布置

試驗養殖池布置：

試驗組1、試驗組2與對照組各設置3個養殖池，共設置9個試驗池，每個養殖池水體體積為4.8 m×3.0 m×1.2 m＝17.28 m3，隨機排列。

浮游期試驗處理：

試驗組1：餌料+10 mL/m3水體/d生物制劑(養殖池水中含活菌數濃度為≥2×105cfu/mL);試驗組2：餌料+15 mL/m3水體/d生物制劑(養殖池水中含活菌數濃度為≥3×105cfu/mL)；

對照組：餌料。

試驗期間餌料中不添加任何抗生素和其他添加劑。

試驗養殖池布置同1.4.1。

稚幼參期、越冬保苗期試驗布置：

試驗組1：餌料中1%添加，并5 mL/m3水體/d潑灑生物制劑；

試驗組2：餌料中2%添加，并10 mL/m3水體/d潑灑生物制劑；

對照組：餌料。

試驗期間餌料中不添加任何抗生素和其他添加劑。

1.4.2 海參成參養殖期試驗布置

成參試驗養殖池布置：

試驗組1、試驗組2、對照組共設3個試驗池，每個養殖池水體為100×667 m3，隨機排列。

試驗池1：5 g腐植酸鈉和10 mL/m3水體/15 d潑灑生物制劑；

試驗池2：10 g腐植酸鈉和15 mL/m3水體/15 d潑灑生物制劑；

對照組：不作任何處理。

使用方法：按照潮汐規律，大潮后全池噴施，大換水等管理措施，按常規方式進行。

1.5 試驗時間和試驗地點

浮游期試驗時間∶2012年6月3日～6月18日，試驗期為15 d；

稚幼參期試驗時間：2012年7月21日～8月5日，試驗期為15 d；

越冬保苗期試驗時間：2011年3月11日-～5月25日，試驗期為15 d；

成參養殖期試驗時間：2011年5月1日～11月15日。

試驗地點：大連渤海灣海珍品科技開發公司種苗孵化場、外海海參圈內。

1.6 枯草芽孢桿菌和弧菌檢測及觀察

枯草芽孢桿菌培養：采用細菌培養基，平皿培養，稀釋涂平板法計數；

弧菌培養：采用國標購買的TCBS培養基，平皿培養，稀釋涂平板法計數；

海參幼體形態觀察采用普通光學顯微鏡放大15×10倍觀察；

海參幼體胃內微生物數量觀察采用普通光學顯微鏡放大15×40倍觀察；

每個試驗處理觀察幼體和微生物均為10個幼體，3次重復，取平均值計數。

2 結果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌BS-2018生物學特性

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，芽孢桿菌屬，細胞呈直桿狀，單個細胞0.7～0.8×2～3 μm，革蘭氏陽性菌，無莢膜，周生鞭毛，能運動。芽孢大，橢圓形或柱狀，0.6～0.9×1.0～1.5 μm，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。能夠很好的利用淀粉、檸檬酸鹽、丙酸鹽。在厭氧條件下、氯化鈉含量在10%以下均能生長。生長溫度范圍在30～55 ℃，最適溫度35 ℃。pH值范圍在5.6～8.8。菌落形態為污白色或微黃色不透明，表面粗糙，邊緣無規則，不整齊。在液體培養時，常形成皺醭。

2.2 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑的生產過程

試管斜面菌種→三角瓶液體種子→發酵罐液體種子培養→發酵罐液體發酵培養。發酵罐液體發酵培養結束后，用平皿培養法檢測，含枯草芽孢桿菌芽孢≥200×108cfu/g合格產品，密閉條件下灌裝，得到枯草芽孢桿菌芽孢生物制劑，入庫備用。

2.3 枯草芽孢桿菌BS-2018在海參育苗浮游期的應用效果

枯草芽孢桿菌BS-2018(濃度為200×108cfu/mL)在海參育苗浮游期應用效果的試驗見表1。

枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑日投量10～15 mL/m3水體，每天換水1/2水體，幼體吞噬正常，沒有任何不良反應。用15×10倍顯微鏡觀察試驗組幼體，看到邊緣整齊，清晰，幼體發育正常。用15×40倍顯微鏡觀察試驗組幼體胃的形狀和活力，看到幼體胃形正常、飽滿度好、攝食正常，變態整齊，胃中枯草芽孢桿菌等分布均勻，對照組幼體胃中，枯草芽孢桿菌和芽孢菌類明顯少于試驗組。從表1可以看出，枯草芽孢桿菌在水體中存活繁殖，能抑制弧菌增殖。幼體的爛邊病、爛胃病的發病率明顯降低，海參幼體成活率明顯提高。

表1 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在海參浮游期的應用效果(20 ℃±1)Tab.1 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber planktonic period (20 ℃ ±1)

2.4 枯草芽孢桿菌BS-2018在海參稚幼期的應用效果

枯草芽孢桿菌B S-2018(濃度為200×108cfu/mL)在海參稚幼期的應用效果試驗見表2。

從表2數據可以看出，在海參稚幼期中，枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑，在餌料中1%添加和5 mL/m3水體潑灑，每天應用1次，可以使幼參增產18.14%；在餌料中2%添加和10 mL/m3水體潑灑，每天應用1次，可以使幼參增產15.25%。海參體重、體長明顯增加。

2.5 枯草芽孢桿菌BS-2018在海參越冬保苗期的應用效果

枯草芽孢桿菌B S-2018(濃度為200×108cfu/mL)在海參越冬保苗期的應用效果試驗見表3。

從表3可以看出，在海參越冬保苗中，枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在餌料中1%添加和

5 mL/m3水體潑灑，每天應用1次，可以使幼參增產11.18%；在餌料中2%添加和10 mL/m3水體潑灑，每天應用1次，可以使幼參增產16.77%。海參體重、體長明顯增加。

表2 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在海參稚幼期的應用效果Tab.2 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber juveniles immature period

表3 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在海參越冬保苗期的應用效果Tab.3 Application effects ofBacillus subtilisBS-2018 as biological agent on the sea cucumber winter seedling period

2.6 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在海參成參養殖期的應用效果

枯草芽孢桿菌BS-2018(濃度為200×108cfu/mL)和腐植酸鈉在海參成參養殖期的應用效果試驗見表4。

從表4可以看出，在海參圈的成參養殖中，試驗組1腐植酸鈉5 g和枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑10 mL/m3水體潑灑，15 d應用1次，可以使成參增產11.32%；試驗組2腐植酸鈉10 g和枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑15 mL/m3水體潑灑，15 d應用1次，可以使成參增產17.82%。

在海參圈成參養殖中，15 d應用1次，腐植酸鈉的應用量10 g/m3水體，枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑15 mL/m3為最佳。不但可以增產，還可以有效地減少由于弧菌引起的海參圈海參周身腐爛病等病害，還有調控水質，凈化水域環境作用。

表4 枯草芽孢桿菌BS-2018生物制劑在海參成參養殖期的應用效果Tab.4 Application effects ofBacillus subtilis BS-2018 as biological agent on the sea cucumber parameters breeding period

3 結論

(1) 枯草芽孢桿菌BS-2018在海參育苗浮游期(10～15 mL/m3水體/d潑灑)應用，可使海參幼體成活率分別提高到22.3%、35.3%，發病率分別降低到18.0%、26.0%。在海參稚幼期(餌料中1～2%添加和5～10 mL/m3水體/d潑灑)應用，可使海參稚幼參增產15.25%～18.14%。在海參越冬苗保苗期(餌料中1～2%添加和5～10 mL/m3水體/d潑灑)應用，可使海參稚幼參增產11.18%～16.77%。

(2) 腐植酸鈉和枯草芽孢桿菌生物制劑，在海參圈中的成參養殖中應用，按照潮汐規律，大潮換水后(15 d 1次)應用，用量為腐植酸鈉5～10 g/m3水體和枯草芽孢桿菌10～15 mL/m3水體，方法為全池潑灑，可使成參增產11.32%～17.82%，并可以有效地減少由于弧菌引起的海參圈海參周身腐爛病等病害。還有調控水質，凈化水域環境作用。腐植酸鈉和枯草芽孢桿菌生物制劑在海參成參養殖應用，沒有任何毒副作用和不良反應。

(3) 枯草芽孢桿菌和腐植酸鈉作為生態型微生物制劑和營養型生物餌料，在海參養殖中應用，有利于海參營養物質的轉化吸收和新陳代謝，可以減少腸道疾病的發生，明顯提高海參產量。枯草芽孢桿菌和腐植酸鈉微生態制劑在海參養殖中的應用，將會取得良好的經濟效益、社會效益和生態效益，具有廣闊的前景。

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