蛇床子素對神經退行性疾病的作用及機制

路遙 曾常茜

（大連大學醫學院，遼寧大連116622）

蛇床子素（osthole）是最先從傘形科植物中提取分離出的天然香豆素類化合物，其在傘形科一年生草本植物蛇床 Cnidium monnieric（L.）Cuss.的干燥成熟果實中含量較高（約為2%）?，F代藥理學實驗研究表明：蛇床子素具有抗腫瘤、抗炎、抗痙攣、抗凝血等功效[1-3]。隨著對蛇床子素的深入研究發現，其在神經系統退行性疾病中亦有重要作用，如減少神經元凋亡、抑制炎癥因子釋放、維持血腦屏障完整性等[4-6]。本文就蛇床子素對神經退行性疾病的作用及相關機制作一綜述。

1 蛇床子素概述

蛇床子素，別名歐芹酚甲醚、甲氧基歐芩酚，其化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素（7-methoxy-8-[3-methylpent-2-enyl]coumarin），存在于當歸屬、古當歸屬、綿果芹屬、蛇床屬、阿魏屬、獨活屬、巖風屬、歐防風屬、歐芹屬、前胡屬、茴芹屬、栓翅芹屬、亮蛇床屬、西風芹屬、白芷屬等多屬植物中[7]。蛇床子素屬于香豆素類化合物，分子量為224.29，其結構由苯環、吡喃酮環和異戊烯結構組成，其中苯環和吡喃酮環是其核心結構，如圖1所示[8]。低含量（35%，50%等）蛇床子素為黃綠色粉末，高含量（90%以上）蛇床子素為白色針狀結晶粉末。蛇床子素可溶于堿溶液、甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、醋酸乙酯和沸石油醚等，不溶于水和石油醚。

圖1 蛇床子素化學結構

2 蛇床子素與神經退行性疾病

2.1 蛇床子素與缺血性腦損傷

腦血管病是危害人類生命和健康的常見病。腦缺血損傷所涉及的病理生理機制十分復雜，包括氧自由基生成過多、炎癥因子分泌增加、凋亡相關基因激活、血腦屏障破壞等多種病理過程[9]。

Ji HJ等[4]通過永久性結扎雙側總動脈閉塞（permanent occlusion of bilateral common carotid arteries，2VO）大鼠建立腦缺血性損傷模型，通過Morris水迷宮①Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初（1981）設計并應用于腦學習記憶機制研究的一種實驗手段，其在阿爾茨海默?。ˋD）研究中的應用非常普遍實驗發現蛇床子素可以明顯改善2VO大鼠的空間學習及記憶能力,研究結果表明：蛇床子素可以改善大鼠缺血性腦損傷認知缺陷。Mao X等[6]通過大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立大鼠局灶性腦缺血模型，觀察蛇床子素對改善腦缺血所致的認知缺陷及神經元損傷的作用，結果發現，蛇床子素預處理MCAO大鼠 7 d，其神經病理學得分為1.43±0.20，較MCAO大鼠明顯降低（P＜0.05），神經病理學損傷明顯改善，梗死面積較未用蛇床子素處理組大鼠明顯減少。Chen T等[10]將皮質神經元置于缺氧缺糖（OGD）環境中培養 4 h，并用 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）實驗研究蛇床子素對OGD損傷模型神經元存活率的影響，結果發現，在OGD前2 h，分別用不同濃度蛇床子素預處理的神經元，其存活能力隨著蛇床子素的濃度增加而增加。以上研究表明：蛇床子素對缺血性腦損傷所致神經元損傷具有保護作用。

2.1.1 在腦缺血性損傷時 腦內自由基產生、清除狀態受到破壞，氧自由基大量產生并攻擊生物膜的脂類、糖、蛋白質及細胞內的核酸，從而導致神經細胞死亡[9]。Ji HJ等[4]用2VO模型研究蛇床子素的抗氧化能力發現，蛇床子素處理2VO大鼠3周后，大鼠的海馬勻漿中丙二醛（MDA）含量顯著低于2VO組大鼠；蛇床子素處理組大鼠海馬勻漿中過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性明顯高于2VO組大鼠。Chao XD等[5]采用MCAO模型，發現蛇床子素預處理組大鼠腦梗死區和缺血半暗區較MCAO組谷胱甘肽（GSH）活性明顯增加，髓過氧化物酶（MPO）活性及MDA含量明顯降低。由此可見，蛇床子素通過減弱過量氧自由基形成并且增加抗氧化能力發揮保護神經元的作用。

2.1.2 腦缺血損傷后 白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等產生增加，誘導缺血區腦組織中白介素-8（IL-8）生成增加。IL-8是免疫性炎癥反應過程中的炎性趨化細胞因子，在缺血性腦損傷中起著重要作用。腦缺血損傷后，缺血區腦組織中IL-8生成增加，使大量中性粒細胞激活，促進其趨化和浸潤，并釋放毒性氧自由基、細胞因子和一些炎癥介質，導致局部腦水腫和腦組織壞死。一氧化氮合酶（NOS）是一氧化氮（NO）合成的限速酶，誘導型NOS（iNOS）在生理條件下不表達，在神經元受到損傷或炎癥反應時被大量激活，持續產生大量NO，發揮細胞毒性作用，誘導神經元細胞凋亡[11]。 Chao DX 等[5]、Li F 等[12]研究發現，蛇床子素可以明顯降低 MCAO 大鼠 IL-1β，IL-8，TNF-α，環氧合酶-2（COX-2），iNOS等炎癥因子，表明蛇床子素可以通過抗炎作用對抗腦缺血損傷。

B細胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）是一種抗凋亡蛋白，Bcl-2相關X蛋白（Bax）是一種促凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比例關系是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，而且半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）在凋亡起始階段起主要作用。Ji HJ等[4]通過檢測2VO大鼠海馬組織凋亡相關蛋白，發現2VO大鼠海馬Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白表達上調、caspase-3激活，而蛇床子素明顯抑制Bcl-2表達下調、Bax表達上調并減輕caspase-3的激活；由此提示，蛇床子素對缺血性腦損傷具有一定的保護作用，其機制可能與通過調控凋亡相關蛋白，抑制細胞凋亡有關。

在缺血性腦損傷大鼠神經元中c-Jun氨基端激酶（JNK）通路高度激活c-Jun磷酸化，并且在缺血所致的凋亡中具有重要作用[13]。在MCAO模型建模后3 h，給大鼠腹腔注射0.1 mg/kg D-JNKI1（JNK抑制劑），使腦損傷區域從（8.2± 8.5）mm 降低到（13.9 ± 6.2）mm[13]。 Chen T 等[10]又進一步通過蛋白質印記（Western blot）檢測神經元胞外信號調節激酶（ERK）1 和 ERK 2（統稱為 ERK1/2）及JNK活化情況，結果發現，蛇床子素能明顯延長ERK1/2的活化時間并抑制JNK活化，表明蛇床子素對腦缺血神經元損傷具有保護作用，其機制與蛇床子素通過調控ERK1/2、JNK信號通路，進一步發揮其抗凋亡作用有關。

文獻報道基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）在腦缺血的病理過程中具有重要作用。腦缺血患者腦組織MMP-9酶原和活化的MMP-9迅速增加，活化的MMP異常增加將促進蛋白質的異常水解，因此而破壞血腦屏障的完整性及增加梗死面積[14]。Mao X等[6]通過Western blot和明膠酶譜分析法研究發現MCAO組大鼠海馬MMP含量及活性增高，蛇床子素可以明顯降低MMP含量、抑制MMP活性，提示蛇床子素可能是通過抑制MMP，進而保存血腦屏障完整性從而發揮神經保護作用。

2.2 蛇床子素與自身免疫性腦脊髓炎（EAE）

EAE是一種主要由CD4（人體免疫系統中的1種重要免疫細胞）陽性Th1細胞（CD4+Th1）介導的，以中樞神經系統內小血管周圍單核細胞浸潤和髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病。

在EAE的炎癥應答反應中Th1細胞激活小膠質細胞，并促進小膠質細胞分泌子干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、TNF-α 等促炎因子，導致神經纖維脫髓鞘。神經生長因子（NGF）可以通過調節中樞神經系統細胞亞群（Th1與Th2）細胞因子之間的平衡而作為一種抗炎介質，并且可以降低 EAE中IFN-γ的水平[15]。Chen XH等[16]通過給C57BL/6小鼠注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55氨基酸肽（MOG35-55）建立 EAE模型，并在注射MOG35-55 7 d（亞臨床階段）和13 d（臨床階段）后分別用蛇床子素處理，結果發現，在亞臨床階段用蛇床子素治療可以推遲疾病過程，而在以上2種階段用蛇床子素治療均可以減弱小鼠炎癥和髓鞘脫失并改善磁共振成像結果。此外，蛇床子素可以增加NGF分泌并抑制IFN-γ分泌。由此可見：蛇床子素通過調節IFN-γ對EAE發揮保護作用。

2.3 蛇床子素與帕金森?。≒D）

PD又稱震顫麻痹，是一種常見的神經功能障礙疾病，是中老年人最常見的中樞神經系統疾病，其病理特征以黑質部位的多巴胺能神經元變性為主。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常情況下存在于細胞質中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外，因此，通過檢測腦組織中LDH的活性，可判斷細胞受損的程度。細胞色素C（細胞色素的1個亞類）是一種水溶性蛋白，具有調控細胞能量代謝和凋亡的雙重功能。Liu WB等[17]使用N-甲基哌嗪（MPP＋）處理PC12細胞（1種常用的神經細胞株）建立多巴胺能神經元損傷模型，并觀察蛇床子素預處理后對MPP＋損傷PC12細胞的保護作用，結果發現，蛇床子素預處理可以明顯改善PC12細胞活性，降低LDH的釋放，表明蛇床子素對多巴胺能神經元細胞具有保護作用。進一步通過Western blot技術檢測PC12細胞Bax，Bcl-2和細胞色素C的蛋白表達水平，結果發現：蛇床子素＋MPP＋處理組與單純MPP＋處理組相比Bax表達升高幅度和Bcl-2表達下降幅度均顯著減少，Bax/Bcl-2的比值也明顯降低，細胞色素C釋放量明顯減少。表明蛇床子素可能通過降低Bax/Bcl-2的比值減少神經元的凋亡，減少細胞色素C的釋放來調控能量代謝，從而發揮保護多巴胺能神經元的作用。

2.4 蛇床子素與AD

AD是一種以認知障礙、記憶減退為臨床特征的老年性中樞神經退行性疾病，其病理學特征為β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內異常聚集，膠質細胞過度活化并釋放炎性介質引起神經毒性作用，最終導致神經元凋亡[18]。

神經炎癥在AD發病過程中的作用越來越受到重視，現在研究表明[19]，在AD腦中存在持久的炎癥反應。龔其海等[19]通過側腦室注射脂多糖誘導大鼠的神經炎癥模型，蛇床子素組大鼠在造模前3 d，每日1次灌胃40 mg/kg蛇床子素，造模后5 d，開始Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力，蘇木精-伊紅染色（HE染色）觀察大鼠海馬神經元損傷情況，發現蛇床子素可明顯縮短大鼠定向航行實驗中的逃避潛伏期，延長空間探索實驗中的校正逃避潛伏期，減輕海馬神經元損傷；進一步通過實時定量PCR(real time-PCR)法測定海馬炎癥因子信使核糖核酸（mRNA）水平，結果發現，蛇床子素顯著降低大鼠海馬組織中TNF-α，IL-1β，NOS2和Cox-2的mRNA表達水平。表明蛇床子素可減輕脂多糖誘導的大鼠學習記憶減退及海馬神經元損傷，其機制與抑制炎癥相關基因的mRNA表達有關。

細胞在靜息狀態下，核因子-κB（NF-κB）以無活性的潛在狀態存在于細胞漿中，與NF-κB抑制性蛋白（IκB）結合組成異源多聚體（p50-p65-IκBα或 p50-p65-IκBβ）。當細胞受到 NF-κB 激活劑刺激時胞漿中的 NF-κB三聚體復合物中的 IκB發生磷酸化，隨后賴氨酸殘基發生泛素化，在蛋白酶小體作用下裂解，從三聚體中解離出來，從而使p50-p65異二聚體表現出NF-κB活性，活化的NF-κB從細胞漿易位至細胞核內，與NF-κB序列結合，發揮轉錄調控作用。在病理情況下，腦內大量沉積的Aβ能夠誘導星形膠質細胞內的 NF-κB過度活化，釋放炎癥因子、產生氧化應激反應等，促進神經元凋亡。程淑意等[20]用40μmol/L的Aβ25-35作用于星形膠質細胞 24 h，結果發現，NF-κB過度活化，IκBα（NF-κB 的抑制 蛋 白 ）發 生 磷 酸 化 及 降解。蛇床子素（0.01～ 1μmol/mL）可顯著抑制Aβ25-35誘導的 NF-κB過度活化，上調細胞核內IκBα的表達。表明蛇床子素通可以拮抗 Aβ25-35的神經毒性作用，延緩AD發生發展的作用機理可能與上調星形膠質細胞中IκBα的表達，抑制NF-κB的過度活化表達有關。

2.5 蛇床子素與癲癇

癲癇（epilepsy）是由多種原因引起的神經元反復同步化異常放電所致的突然性、反復性和短暫性的運動、感覺、意識、精神、植物神經等功能異常的腦部疾病，典型的臨床表現為癲癇持續狀態。Luszczki JJ等[21]通過對小鼠最大電休克誘導癲癇模型，并在腹腔注射蛇床子素后15，30，60及120 min分別觀察其抗驚厥作用，結果發現，其半數有效量（ED50）為 259～631 mg/kg。Luszczki JJ 等[22]對蛇床子素、歐前胡素和丙戊酸3種藥物的抗驚厥和神經毒害作用進行比較，結果發現，3者的 ED50分別為 253～639，167～290，167～290 mg/kg，半數中毒量（TD50）為：329～443，531～648，363～512 mg/kg，保護指數（TD50/ED50）分別為：1.13～2.60，0.83 ～2.44，1.72～2.00，可以看出，蛇床子素在最大電休克誘導的癲癇模型中抗驚厥作用與丙戊酸相似，推測蛇床子素在抑制癲癇發作方面具有潛在的應用價值。

3 展望

隨著對蛇床子素化學結構、藥理學作用的深入研究，目前蛇床子素已由傳統應用向新領域拓展，對腦缺血性損傷、EAE、PD、AD等多種神經退行性疾病顯示出良好的療效，其作用機制主要與抗炎、抗氧化、抗凋亡、維持血腦屏障完整性等作用有關。在抗癲癇方面，雖然有研究表明：蛇床子素對電休克誘導大鼠癲癇模型具有抗驚厥作用[21-22]，但是其作用靶點、作用機制尚不明確，且對其他類型癲癇模型是否亦有抗痙攣作用尚未見報道，應需進一步研究。隨著蛇床子素對神經退行性疾病作用機制和有效靶點的不斷深入研究，相信可以使蛇床子素在防治神經疾病領域中得到更廣泛的應用。

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