鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物ET-1、CGRP含量的影響△

侯虹麗，孫芳玲，咸明慧，趙潤懷，肖蘇萍，蔣瑩，艾厚喜，張麗，王文*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院，北京 100053； 2.北京祈福瑞草醫(yī)藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物ET-1、CGRP含量的影響△

侯虹麗1，孫芳玲1，咸明慧2，趙潤懷3，肖蘇萍3，蔣瑩1，艾厚喜1，張麗1，王文1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院，北京 100053； 2.北京祈福瑞草醫(yī)藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

目的：研究鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)含量的影響。方法：75只ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型組、鼻腦通鼻用噴霧劑低、中、高劑量組，每組15只。采用硝酸甘油皮下注射制備小鼠實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型，造模后20 min開始記錄小鼠前肢搔頭的次數(shù)，記錄10 min；造模4 h后腹主動(dòng)脈取血，測定血漿中ET-1、CGRP指標(biāo)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物搔頭次數(shù)顯著增多(P<0.001)；提前給予鼻腦通鼻用噴霧劑3個(gè)劑量后，造模小鼠的搔頭次數(shù)均比模型組顯著減少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物血漿ET-1含量顯著升高(P<0.001)、CGRP含量升高(P<0.01)；而與模型組相比，提前給予鼻腦通鼻用噴霧劑3個(gè)劑量后，造模的動(dòng)物血漿中、高劑量組ET-1含量顯著降低(P<0.001，P<0.001)，低、中、高劑量組CGRP含量均降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。結(jié)論：鼻腦通鼻用噴霧劑能減少實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物的搔頭次數(shù)，其治療偏頭痛的機(jī)制可能與降低動(dòng)物血漿ET-1、CGRP含量有關(guān)。

鼻腦通鼻用噴霧劑；實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠；搔頭次數(shù)；ET-1；CGRP

偏頭痛是一種臨床常見的慢性血管神經(jīng)性疾病，嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量。雖然現(xiàn)代臨床有多種學(xué)說，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療較易反復(fù)，給患者帶來較大精神壓力。目前臨床治療多選用化學(xué)藥，如麥角胺制劑、5-HT1B/1D受體激動(dòng)劑、抗精神病類藥等，雖然起效快，但存在禁忌癥較多、價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)及毒副作用大等不足。因此，從長遠(yuǎn)治療效果來看，藥性平和、不良反應(yīng)小的中藥治療偏頭痛效果更持久，值得深思和探討。

鼻腦通鼻用噴霧劑是根據(jù)中醫(yī)“腦竅通于鼻”、“納鼻而通十二經(jīng)”的理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)鼻黏膜吸收原理研發(fā)的鼻用噴霧劑，集川芎、大果木姜子、萊菔子、冰片、人工麝香等辛溫活血、通竅止痛的中藥組方，經(jīng)大果木姜子、萊菔子、川芎提取揮發(fā)油后，藥渣加水提取、濃縮、醇沉、靜置，回收乙醇至無醇味，浸膏備用；人工麝香乙醇超聲提取，水提；冰片乙醇溶解液與揮發(fā)油、人工麝香醇提取液以羥丙基-β-環(huán)糊精包合；各液混合后加羥苯乙酯和水，調(diào)整至一定體積，灌裝而成。動(dòng)物藥效、毒理試驗(yàn)研究和藥物穩(wěn)定性研究證明，本藥具有速效止痛的藥效，無明顯毒副作用，且質(zhì)量穩(wěn)定可控，目前已獲得國家藥物臨床試驗(yàn)批件。實(shí)驗(yàn)通過觀察鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)硝酸甘油偏頭痛小鼠模型搔頭次數(shù)及血漿中內(nèi)皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)水平的影響，以探討鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)偏頭痛的影響及可能機(jī)制，為尋找預(yù)防和治療偏頭痛的有效藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR種小鼠75只，雌雄各半，體重18～22 g。由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0012。

1.2 藥品與試劑

鼻腦通鼻用噴霧劑(中國藥材公司，規(guī)格：0.8 mg·mL-1，即1mL溶液中含有0.8 mg生藥量)。

硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，1 mL∶5 mg，批號(hào)：20130317)，ET-1試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：LOT M20130328，生產(chǎn)日期：20130328)。CGRP試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：LOT M20130328，生產(chǎn)日期：20130328)。

1.3 儀器

R-320低溫高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限責(zé)任公司)，Thermofisher Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥劑量

取受試小鼠75只，按體重隨機(jī)分成5組，即對(duì)照組，模型組，鼻腦通鼻用噴霧劑低、中、高劑量組，每組15只。給藥組動(dòng)物鼻腔給予鼻腦通鼻用噴霧劑低劑量(0.1 g生藥·kg-1)、中劑量(0.2 g生藥·kg-1)、高劑量(0.4 g生藥·kg-1)，1次/天，連續(xù)給藥3 d。對(duì)照組和模型組鼻腔給予同體積蒸餾水。

2.2 偏頭痛模型的復(fù)制方法

各組動(dòng)物末次給藥后30 min，模型組和各給藥組皮下注射硝酸甘油5 mg·kg-1，空白對(duì)照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

2.3 小鼠前肢搔頭次數(shù)的行為學(xué)監(jiān)測

造模20 min后，動(dòng)物出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安現(xiàn)象，此現(xiàn)象持續(xù)約3 h，繼而出現(xiàn)蜷臥、活動(dòng)減少狀態(tài)。因此，造模后20 min開始記錄10 min內(nèi)小鼠前肢搔頭的次數(shù)。

2.4 標(biāo)本處理及ET-1、CGRP含量的測定

造模后4 h，0.4 mL·(100 g)-1水合氯醛麻醉動(dòng)物，經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺取血3 mL，注入抗凝管中，輕輕搖勻靜置。4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，按編號(hào)放入低溫冰箱中-20 ℃貯存?zhèn)溆谩０凑誆T-1、CGRP試劑盒說明，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿ET-1、CGRP含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)偏頭痛模型小鼠搔頭次數(shù)的影響

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠搔頭次數(shù)明顯增多(P<0.001)。而提前給予鼻腦通鼻用噴霧劑后，低、中、高3個(gè)給藥劑量的小鼠搔頭次數(shù)均比模型組顯著減少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，表明鼻腦通鼻用噴霧劑能減少實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠搔頭次數(shù)，見表1。

表1 鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠搔頭次數(shù)的影響

注：與對(duì)照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同

3.2 鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)模型小鼠血漿ET-1含量的影響

各組小鼠血漿ET-1含量對(duì)比見圖1。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血漿ET-1含量明顯升高(P<0.001)。給藥組(中、高劑量)小鼠血漿ET-1含量比模型組顯著降低(P<0.001，P<0.001)，表明鼻腦通鼻用噴霧劑能降低實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠血漿ET-1含量。

圖1 鼻腦通鼻用噴霧劑各劑量組及對(duì)照組、模型組 小鼠血漿ET-1含量對(duì)比

3.3 鼻腦通鼻用噴霧劑對(duì)模型小鼠血漿CGRP含量的影響

各組小鼠血漿CGRP含量對(duì)比見圖2。實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型組小鼠血漿CGRP含量比對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。各給藥組小鼠血漿CGRP含量比模型組含量顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，表明鼻腦通鼻用噴霧劑能降低實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠血漿CGRP含量。

注：與對(duì)照組比較，## P<0.01 圖2 鼻腦通鼻用噴霧劑各劑量組及對(duì)照組、模型組 小鼠血漿CGRP含量對(duì)比

4 討論

偏頭痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明，主要有5-HT、皮層擴(kuò)布性抑制、三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說等機(jī)制。其中三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說被認(rèn)為是偏頭痛發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說[1-3]。在偏頭痛發(fā)作期，顱內(nèi)腦外血管擴(kuò)張，血管周圍神經(jīng)釋放血管活性肽，如：降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮素(ET)、P物質(zhì)(SP)等引起神經(jīng)源性炎癥并釋放許多炎性細(xì)胞因子，以及中樞痛覺傳導(dǎo)的抑制降低，將神經(jīng)、血管、遞質(zhì)三者相結(jié)合，比較全面地解釋了偏頭痛的發(fā)病機(jī)制。

在正常生理情況下，ET和CGRP處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持著腦血管的舒縮功能，調(diào)節(jié)血管彈性，對(duì)維持血管外周壓力和局部血管舒縮功能具有重要意義。研究表明[4-6]，偏頭痛發(fā)作期患者血漿中血管活性物質(zhì)CGRP、ET含量異常，顱內(nèi)血管舒縮功能失衡。ET為強(qiáng)烈的腦動(dòng)脈收縮劑，正常生理狀態(tài)下，ET合成釋放很低，偏頭痛發(fā)作時(shí)ET釋放增加，引發(fā)皮層擴(kuò)布性抑制，ET通過血管平滑肌細(xì)胞膜上的受體與靶細(xì)胞膜結(jié)合，激活鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸肌醇系統(tǒng)和Ca2+通道，增高細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度而影響血管張力，觸發(fā)偏頭痛[1]。CGRP為強(qiáng)烈的血管舒張劑，偏頭痛發(fā)作時(shí)激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，結(jié)果使CGRP釋放增加。有研究顯示[7]，偏頭痛患者血漿CGRP水平升高，使用CGRP受體拮抗劑可顯著減輕偏頭痛的發(fā)作。

硝酸甘油皮下注射實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型是一個(gè)公認(rèn)的偏頭痛模型。造模后動(dòng)物行為癥狀學(xué)表現(xiàn)與人有一定的相似性，是用于研究人類偏頭痛發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)等變化的理想選擇[8]。馮玥等[9]研究顯示，采用硝酸甘油造模后，血漿中CGRP、ET含量明顯升高；寧式穎等[10]造模后，給予首舒康顆粒，血管活性物質(zhì)如CGRP增加受到抑制，從而抑制腦血管異常擴(kuò)張，抑制血漿外滲、血小板活化等所導(dǎo)致的神經(jīng)源性炎癥，從而緩解偏頭痛。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛小鼠搔頭次數(shù)較對(duì)照組明顯增加，血漿ET-1、CGRP水平也明顯升高；鼻腦通鼻用噴霧劑進(jìn)行干預(yù)后，偏頭痛小鼠搔頭次數(shù)顯著減少，血漿兩項(xiàng)指標(biāo)也明顯降低，提示鼻腦通鼻用噴霧劑通過改善血管舒縮功能來預(yù)防偏頭痛的可能機(jī)制。依據(jù)偏頭痛的具體機(jī)制進(jìn)行藥物開發(fā)曾一度被認(rèn)為是遙不可及的，隨著對(duì)偏頭痛神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的研究深入，CGRP受體拮抗劑、前列腺類受體拮抗劑、離子通道拮抗劑等肽類受體拮抗劑已成為治療偏頭痛藥物開發(fā)的新靶標(biāo)[11-12]。鼻腦通鼻用噴霧劑能顯著降低實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物血漿CGRP含量，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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EffectsofBinaotongNasalSprayonET-1andCGRPLevelsinExperimentalMicewithMigraine

HOU Hong-li1，SUN Fang-ling1，XIAN Ming-hui2，ZHAO Run-huai3，XIAO Su-ping3， JIANG Ying1，AI Hou-xi1，ZHANG Li1，WANG Wen1*

(1.XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China； 2.BeijingQifuruicaoPharm-TechCo.，Ltd.，Beijing100094，China； 3.ChinaNationalCorp.ofTraditional&HerbalMedicine，Beijing100195，China)

Objective：To study the effects of binaotong nasal spray on ET-1 and CGRP levels in experimental mice with migraine.Methods：75 ICR mice were randomly divided into 5 groups(n=15)：control group，model group，binaotong nasal spray groups of low dose，middle dose and high dose.Experimental model of migraine mice was performed by hypodermic injection of nitroglycerin.20 min later，the frequency of scratching head was record for 10 min.The plasma ET-1、CGRP levels were detected respectively 4 h later.Results：The frequency of scratching head in model group was increased significantly compared with control group(P<0.001).However，treatment of binaotong nasal spray at three concentrations reduced the frequency of scratching head(P<0.05，P<0.01，P< 0.001).In nitroglycerin-induced migraine model mice，plasma ET-1 level was increased significantly(P<0.001)and plasma CGRP level was increased(P<0.01)compared with control group.However，plasma ET-1 levels were decreased markedly in binaotong nasal spray-treated groups of middle dose and high dose(P<0.001，P<0.001)，plasma CGRP levels were decreased(P<0.05，P<0.01，P<0.01).Conclusion：Binaotong nasal spray could decrease the frequency of scratching head in experimental migraine mice.Furthermore，its mechanisms may be decreaseing plasma ET-1 and CGRP level

Binaotong nasal spray；Experimental migraine mice；Frequency of scratching head；ET-1；CGRP

2013-07-04)

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2011ZX09102-003-05)

*

王文，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理，中藥藥理；Tel：(010)83198881，E-mail：lzwwang@163.com