伏立康唑片在中國健康男性體內的生物等效性研究

邱學文，楊 波，向榮鳳，戴 青，熊麗蓉，歐陽凈，蔡永青，劉 芳，王顯鳳，陳勇川（重慶市西南醫院藥劑科，重慶400038）

伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑類抗真菌藥，為氟康唑的衍生物，具有抗菌譜廣、生物利用度高、安全且可通過血腦屏障等特點。臨床上主要用于治療急性或慢性深部真菌感染、侵襲性去霉菌病、新型隱球菌性腦膜炎，對氟康唑耐藥的嚴重侵入性念珠菌病感染（包括克魯斯念珠菌）以及由足放線菌屬和鐮刀菌屬引起的嚴重真菌感染[1-3]，還可以用于預防侵入性真菌感染免疫功能低下的患者[4-5]。伏立康唑的抗菌機制為抑制真菌細胞色素P450介導的14α-甾醇的去甲基作用，從而抑制真菌麥角甾醇的合成，導致真菌細胞膜合成不足[6-7]。

伏立康唑口服吸收迅速，達峰時間為1 ～ 2 h，生物利用度96%，食物可影響其吸收，在餐前1 h或餐后2 h服用，藥物的吸收增加。體內代謝呈非線性藥動學特性，即本品藥動學的個體差異很大。隨給藥劑量增加，藥物曲線下面積（AUC）成比例增加，但在兒童體內，伏立康唑代謝表現為線性藥動學特性，即如果要達到相同的藥物濃度，需服用較高劑量[8]。伏立康唑主要在肝臟通過細胞色素P450同工酶CYP2C19進行代謝。代謝物主要經尿液排泄，小于5%的藥物以原型隨尿液排出。伏立康唑的蛋白結合率約為58%，肝腎功能不全對伏立康唑的蛋白結合率無影響[8]。本試驗主要研究國產伏立康唑片與進口伏立康唑片在中國健康成年男性志愿者中的藥動學參數和相對生物利用度，以評價兩者的生物等效性，為臨床合理用藥提供理論依據。

1 儀器與試劑

液相色譜系統包括紫外檢測器，四元輸液泵，自動進樣器，切換閥及數據采集和處理系統（美國Agilent公司）；高速離心機（美國Abbott公司）；超純水器（MiLLi-Q plus，USA，MiLLipore公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；振蕩器（IKA-VORTEX）。

伏立康唑對照品（批號：100862-200701，中國藥品生物制品檢定所）；卡馬西平對照品（內標，批號：100142-201004，中國藥品生物制品檢定所）；受試制劑：伏立康唑片（200 mg/片，批號：100302，成都華神集團股份有限公司制藥廠）；參比制劑：伏立康唑片（200 mg/片，批號：B10002040，美國輝瑞公司）；甲醇、乙腈為色譜純；三乙胺（分析純，成都化學試劑廠）；冰醋酸（分析純，重慶川東化工（集團）有限公司）；空白血漿由西南醫院血庫提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相為乙腈-水-冰醋酸-三乙胺 = 42∶58∶0.1∶0.05；流速：1.4 mL·min-1；檢測波長：256 nm；進樣量：20 μL。

2.2 受試者選擇

健康男性志愿者20名，試驗過程中1名受試者主動退出，共19名受試者完成此次試驗。受試者年齡（22.6±2.3）歲，身高（170.8±4.7） cm，體重（58.1±10.6） kg，試驗前進行體格檢查，血尿常規、肝腎功能、心率、血壓和心電圖等檢查均正常；試驗者既往體健，無藥物過敏史，無吸煙、嗜酒及經常用藥史。2周內未服用任何可能影響本品吸收、代謝的藥物。試驗期間統一清淡飲食，不使用除受試制劑和參比制劑以外的任何藥物，不接受煙、酒及含咖啡的飲料，避免劇烈運動。受試者試驗前簽署知情同意書，本試驗方案經重慶西南醫院醫學倫理委員會審核批準。

2.3 試驗方案

參照《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則》，采用雙周期自身隨機交叉試驗設計，每組受試者每次試驗時分別服用伏立康唑片受試制劑或參比制劑。受試者于試驗前1 d晚餐后，禁食不禁水12 h，次日清晨空腹分別單劑量口服含伏立康唑200 mg的受試制劑或參比制劑，以200 mL溫開水送服，并作記錄。服藥2 h后可自由飲水，服藥4 h后進統一標準餐。試驗期間由醫護人員進行監護。間隔7 d后交叉給藥，重復上述試驗。分別于服藥前0 h和服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h由前臂肘靜脈取血4 mL。血樣置于肝素化的離心管中，3000 r·min-1離心5 min，分離出血漿，置- 30 ℃冰箱中保存備用。

2.4 標準溶液的制備

精密稱取伏立康唑對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度獲得濃度為1 mg·mL-1的儲備液，- 30 ℃冰箱內保存備用。精密稱取卡馬西平對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度獲得濃度為1 mg·mL-1的內標儲備液，在- 30 ℃冰箱內保存備用，用時配成20 μg·mL-1工作液。

2.5 血漿樣品處理

取待測血漿0.8 mL，加入20 μL內標標準溶液（20 μg·mL-1），混勻30 s，再加入100 μL 1.0 mol·L-1NaOH，混勻30 s，再加入3.2 mL乙酸乙酯：正己烷（4∶1），混勻3 min，3000 r·min-1離心5 min，取上層有機相于60 ℃水浴N2吹干，殘渣用200 μL流動相溶解，混勻1 min，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL進樣分析。

2.6 專屬性考察

分別取6份來自不同個體的空白血漿0.8 mL，除不加標準溶液外，其余按“血漿樣品處理”項下操作，進行HPLC分析得空白血漿樣品的色譜圖1A，將一定濃度的標準溶液加入空白血漿中，同法操作得相應的色譜圖1B，結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾伏立康唑和卡馬西平的測定。

圖1 典型的高效液相色譜圖

2.7 標準曲線

取7份空白血漿，加入伏立康唑標準溶液（1 mg·mL-1）適量，使濃度為20 μg·mL-1，再依次用空白血漿稀釋成2000，1000，500，200，100，50，20 ng·mL-1，按上述樣品處理方法操作，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值為縱坐標，進行回歸運算，得直線回歸方程y= 0.670 1x- 0.000 9，r＝0.999 8，表明本方法在20 ～ 2000 ng·mL-1范圍內線性關系良好。本方法最低定量限20 ng·mL-1。

2.8 精密度與回收率實驗

按“標準曲線和定量下限”項下的方法配制低（50 ng·mL-1）、中（200 ng·mL-1）、高（1600 ng·mL-1）三個濃度的伏立康唑樣品，按樣品處理方法處理，在一日內每一濃度進行5樣本分析，計算本法的日內精密度與相對回收率；同時，每一濃度進行5樣本分析，連續測定3 d，計算本法的日間精密度；根據血漿中伏立康唑、卡馬西平的峰面積與相同濃度標準溶液直接進樣測得的伏立康唑、卡馬西平的峰面積之比計算其絕對回收率。具體結果見表1。

表1 精密度及回收率實驗結果Tab 1 Results of precision and recovery test

2.9 數據處理

受試制劑與參比制劑的Cmax和tmax均以實測值表示；AUC0-t以梯形法計算；AUC0-∞按公式計算：AUC0-∞= AUC0-t+Ct/λz（t為最后一次可實測血藥濃度的采樣時間；Ct為末次可測樣本藥物濃度；λz為對數藥-時曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數）；t1/2= 0.693/λz。以各個受試者服用受試制劑與參比制劑的AUC0-t分別計算其相對生物利用度，F=AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。主要藥動學參數經對數轉換后以多因素方差分析（ANOVA）進行顯著性檢驗，然后用雙單側t檢驗和計算90%置信區間的統計分析方法來評價和判斷藥物間的生物等效性。藥動學基本參數的計算與統計學檢驗分析借助DAS Ver 3.0軟件完成。

2.10 血藥濃度測定結果及藥動學參數

19名受試者口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑200 mg后的平均藥-時曲線見圖2，主要藥動學參數見表2。對同一受試者服用兩種制劑的藥動學參數進行配對t檢驗，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。以參比制劑為對照，受試制劑的相對生物利用度為（100.5±3.4）%。

圖2 19名健康志愿者單劑量口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑后的平均藥-時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of voriconazole in 19 healthy volunteers after single oral dose of voriconazole tablets

2.11 生物等效性評價

受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC經對數轉換后進行方差分析，并進一步采用雙單側t檢驗和（1-2α）置信區間法進行生物等效性評價，tmax采用非參數檢驗法。伏立康唑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒絕生物不等效假設（P＞ 0.05）；受試制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%置信區間分別為參比制劑相應參數的73.7% ～ 109.5%、92.4% ～ 116.5%和93.3% ～ 115.6%；非參數檢驗結果顯示，兩種制劑的tmax差異無統計學意義（P＞ 0.05）。以上結果表明兩種制劑具有生物等效性。

表2 19名健康志愿者單劑量口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑后的主要藥動學參數Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of voriconazole in 19 healthy volunteers after single oral dose of voriconazole tablets

2.12 不良事件

整個試驗過程由經《藥物臨床試驗管理規范》（GCP）培訓的臨床醫師和護士進行觀察，19名受試者在服用含伏立康唑200 mg的受試制劑或參比制劑后均無不適主訴，亦未觀察到不良事件。

3 討論

本試驗中，19例健康男性受試者雙周期隨機交叉單劑量口服試驗制劑和參比制劑, 服藥劑量均為200 mg。試驗結果表明,口服給藥后，試驗制劑和參比制劑在健康志愿者的體內過程非常接近，主要藥動學參數差異無統計學意義（P＞ 0.05），單次口服試驗制劑的伏立康唑片平均相對生物利用度為（102.9±15.3）%，雙單側t檢驗和（1-2α）置信區間檢驗表明兩種制劑具有生物等效性。

本次研究結果與高洪志等[9]的研究比較，參比試劑和受試制劑的達峰時間tmax和半衰期值相近，Cmax和AUC0-∞相差約1.7倍。分析差異的原因可能是由于本次研究的受試者年齡為（22.6±2.3）歲，而高洪志等研究中受試人群相比年齡較小，故受試者代謝快，Cmax和AUC0-∞較??；另外，高洪志等的研究采用的是中國北方的受試者，而本次研究招募的是西南地區的受試者，地域分布的原因也可能使Cmax和AUC0-∞較小。Driscoll等[10]研究發現青少年人群達到成年人群相同藥物濃度需給予更大的伏立康唑劑量。由于該試驗的研究對象均為健康男性，且為單劑量給藥，人群范圍窄，年齡均較年輕化，故結果不能代表或推斷出兒童、老年人群的給藥指數。如進一步確認國內人群伏立康唑藥動學參數的差異，需增加受試者的病例數，并且考察伏立康唑代謝酶基因型分布及多態性對伏立康唑代謝的影響。

在整個試驗過程中，由負責醫生于給藥前及給藥后24 h測量受試者的血壓、體溫、呼吸、脈博，并在試驗結束后進行血液生化、血常規及尿常規檢查，結果受試者無不良反應發生，檢查指標未見異常，表明試驗藥物在試驗劑量下具有較好的安全性。

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