蘇云金芽胞桿菌晶體毒素的多樣性

趙新民， 劉淑云， 周攀登， 徐 玲， 夏 莉， 夏立秋， 成飛雪

（1.湖南城市學院化學與環境工程系，益陽 413000；2.湖南師范大學生命科學學院微生物分子生物學湖南省重點實驗室，長沙 410081；3.湖南省植物保護研究所，長沙 410125）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis Berliner，簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，在昆蟲尸體、土壤、水體、沙礫和落葉等多種生態環境下生存。據估計全世界分離保存的Bt菌株已有6萬多個。按Bt菌株營

養細胞鞭毛的免疫反應將其劃分為不同的血清型。目前已發現71個血清型、84個亞型［1］。

蘇云金芽胞桿菌的殺蟲活性范圍包括無脊椎動物節肢動物門中的鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、直翅目（Orthoptera）等9個目的昆蟲，同時還發現對線形動物門（Nemathelminthes）、原生動物門（Protozoa）中某些有害種類有殺蟲活性［2］。Bt制劑已發展成為目前世界上應用最為廣泛的微生物殺蟲劑。

Bt的殺蟲活性主要來自于菌體內在形成芽胞期間生成的伴胞晶體。Bt在營養體生長到穩定期的后期，在其一端或中央開始形成一個卵圓形的芽胞，生長至衰亡期后芽胞囊破裂，芽胞被釋放出來。形成芽胞的過程中，在菌體內的一端或兩端形成一個或多個形狀一致或不同的伴胞晶體［3］。伴胞晶體是Bt的主要毒力因子，其含量可以占到芽胞形成過程中菌體產生蛋白總量的20%～30%［4］。伴胞晶體主要為δ內毒素的殺蟲晶體蛋白，又稱為晶體毒素或簡稱為毒素，毒素被敏感昆蟲的幼蟲吞食后，在幼蟲腸道堿性環境和蛋白酶的作用下釋放出活性毒素，活性毒素與幼蟲中腸上皮細胞的特異受體發生結合并形成孔道，破壞細胞滲透壓平衡，最終導致昆蟲死亡［4］。

1995年Crickmore等在無脊椎動物病理學年會上首次提出、并于1998年發表了Bt毒素新的命名原則［5］，即只根據毒素蛋白氨基酸序列的同源性確定其不同的分類等級，而與其生物活性無關，從而形成了一個趨向完善的、開放式分類系統。這個系統利用計算機比較毒素氨基酸序列的同源性，以45%、78%和95%為界，將毒素劃分為4個分類等級，依次用阿拉伯數字、大寫英文字母、小寫英文字母和阿拉伯數字表示。氨基酸同源性在45%以下的，為第一等級，用阿拉伯數字表示；同源性在45%～78%之間的，為第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78%～95%之間的，為第三等級，用小寫英文字母表示；這一級又稱為模式毒素（holotype toxin）。同源性在95%以上的，為第四等級，用阿拉伯數字表示。該系統實際上是一個開放系統，新發現的Bt毒素與已知毒素序列比對，就可以提交這一分類系統命名。截止到2012年3月1日，已有240種模式毒素被國際Btδ內毒素命名委員會收錄［6］。

目前習慣上根據伴胞晶體蛋白氨基酸序列和毒理機制簡單地分為Cry（crystal）毒素（即通常意義上的晶體蛋白）和Cyt（cytolytic）毒素兩大家族。實際上前者在氨基酸序列、三維結構、靶標生物和殺蟲機理還有很大的不同，還可以繼續劃分為多個毒素類別［7］。由此可將所有已知序列的伴胞晶體蛋白分為3－結構域毒素類、Cyt毒素類、類Mtx1毒素類、二元毒素類、Cry6類、Cry22類和伴胞素（parasporin）類。這種整合分類對于我們從整體上認識Bt毒素的多樣性具有重要意義。

1 各類毒素的結構特點和生物學功能

表1將全部收錄的模式毒素分成Cry毒素和Cyt毒素前后兩部分，并將Cry毒素中的類Mtx1毒素類、二元毒素類、Cry6類、Cry22類和伴胞素類在表1中的位置分別用黃色、綠色、紫紅色、藍色和灰色標出，其中Cry46Aa和Cry46Ab可以分屬于兩個類別。值得注意的是表中有多種毒素并非全部來自Bt，如 Cry16Aa、Cry18Ca、Cry43Ba、Cry49Ab 和Cry70Bb等。其中Cry16Aa來自雙酶梭狀芽胞桿菌菌株（Clostridium bifermentans subsp.malaysia）；Cry49Ab來自球形賴氨酸芽胞桿菌 （Lysinibacillus sphaericus）。Btδ內毒素命名委員會收錄標準是Bt中具有殺蟲活性的伴胞晶體毒素或與之存在較高序列同源性的其他來源毒素［6］。為了討論方便，這里仍將所有模式毒素放在一起。

1.1 3－結構域毒素

在所有已知的Bt晶體毒素中，大多數為3－結構域毒素。3－結構域毒素是目前研究最多Bt毒素，其殺蟲譜較廣。比較毒素的氨基酸序列，可知這些毒素的毒性片段在一級結構上都含有5個保守區。大部分Bt毒素由N－端活性區部分和C－端非活性區部分組成，如 Cry1、Cry4、Cry5、Cry14和 Cry21毒素，分子量大小在120～140ku之間；在被蛋白酶水解激活的過程中，C端有近一半的氨基酸殘基被切除，形成大約60ku的毒性區片段。另外一部分蛋白如Cry2、Cry3、Cry10、Cry19和Cry20毒素只有N－端活性區部分，分子量約為60～75ku，沒有典型的C端延伸的尾巴，被認為是“自然切除”過的蛋白［8］。

已經解析了下列幾種Bt毒素的三維結構：Cry3Aa［9］、Cry1Aa［10］、Cry2Aa［11］、Cry3Bb1［12］、Cry4Ba［13］、Cry4Aa［14］和 Cry8Ea［15］。對其中幾種毒素的結構進行比較［16］，盡管它們的一級結構有較大差異，但它們的三維結構很相似，都是由3個典型的結構域組成。由此推斷，大多數含有5個保守區并有一定的氨基酸序列同源性的毒素都具有3個結構域，它們可能就有相似的毒理機制。結構域Ⅰ主要參與昆蟲中腸上皮細胞細胞膜孔道的形成；結構域Ⅱ參與毒素與受體蛋白的結合并由此決定毒素的殺蟲譜；結構域Ⅲ的功能尚不明確，可能具有多種功能［17］。最近我們研究了Cry1Ac毒素結構域Ⅲ中的色氨酸 W544［18］和天冬酰胺 N546［19］的作用。將W544替換成苯丙氨酸（F），在不影響其活性的前提下，大大降低了Cry1Ac毒素對紫外線的敏感性，同時還在一定程度上增強了其對蛋白酶的穩定性，而N546涉及與受體的結合并影響毒素的毒力。

1.2 Cyt毒素

Cyt毒素或稱溶細胞毒素，是Bt伴胞晶體中有別于其他殺蟲晶體蛋白一類毒素。它主要對雙翅目昆蟲有毒殺作用，體外試驗表明Cyt毒素對多種細胞具有毒性［20］。目前已發現9種Cyt模式毒素。到目前為止蚊蟲還沒有對Bt以色列亞種產生抗性，其原因可能是該Bt菌株伴胞中存在CytlA［21］。Cyt2Aa和 Cyt2Ba的三維結構已經解析［22－23］，結構特點是：Cyt毒素沒有典型的3－結構域特征，只包含一個結構域，二個外層α－螺旋發夾結構纏繞一個混合的β折疊。

CytlA由于其特殊性常用來增強殺蚊協同性和延緩蚊蟲對殺蚊毒素的抗性，還用來擴寬殺蟲譜，原因是CytlA與其他毒素在氨基酸序列和毒理作用方面完全不同，它對一些脊椎動物和無脊椎動物細胞有很高的溶解性，對細胞膜脂質部分的非飽和脂肪具有很高的親和力，有人認為它的作用模式是去污劑作用模式［24］（detergent－like mode），即通過結合特異的脂肪酸，攪亂膜結構。也有人認為它可能以形成孔的形式發揮作用。

1.3 類Mtx毒素

Mtx毒素是球形芽胞桿菌（Bacillus sphaericus，Bs）在營養期產生的一類毒素，主要分為Mtx1、Mtx2和Mtx3毒素。Mtx2和Mtx3同產氣夾膜羧菌（Clostridium perfrigens）的33ku的ε－毒素及綠膿桿菌［Pseudomonas aeruginosa（Schroeter）Migula］的32ku細胞毒素有同源性［25］。

Bt伴胞晶體也存在類似Bs的Mtx毒素，這組毒素還包括Cry23／Cry37、Cry15A／40ku、Cry33A／NT32、Cry53、Cry36、Cry46、Cry51。Cry23A 對某些鞘翅目昆蟲具有毒性，通常只有在與較小的Cry37結合在一起才表現出殺蟲活性。Cry23／Cry37復合物的結構已經解析，但其原子坐標未公開。Cry23呈長條形，主要由反向平行的β－折疊組成，并與氣單胞菌溶素（proaerolysin）非常相似，氣單胞菌溶素屬于成孔毒素（β－pore－forming toxin），細菌成孔毒素通過分泌，直接侵襲細胞膜并在細胞膜上形成孔結構，導致在正常情況下不能進入細胞內的離子和其他毒性細胞因子進入細胞內、引起細胞膨脹和細胞溶解［26］。因此推測Cry23／Cry37的毒理機制類似于成孔毒素。

Cry15A與一種與之沒有關聯的40ku蛋白結晶在一起。40ku蛋白本身沒有活性，但可影響Cry15A對煙草天蛾［Manduca sexta（Linnaeus）］的活性［27］。40ku蛋白基因與cry15A 基因存在于同一操縱子內。由于體外難以得到有活性的共結晶，有關的作用機制研究受到限制［28］。編碼Cry33A／NT32的基因也在同一操縱子內［6］。總之，這組毒素氨基酸序列相互之間差異較大，但都有一個保守基元即被兩個富含Ser／Thr側翼序列包圍的兩親環狀結構，預示它與插入細胞膜有關［28］（表2）。

表2 類Mtx毒素來源、結構和毒理機制Table 2 Origins，structures and mechanisms of Mtx－like toxins

1.4 二元毒素組

二元毒素通常指是Bs在芽胞形成過程中產生并通過兩蛋白的相互作用折疊成位于芽胞外膜內的伴胞晶體，由 BinA （41.9×103）和 BinB （51.4×103）組成。單獨的BinA蛋白對蚊蟲的毒力低，而單獨的BinB對蚊蟲無毒，只有兩蛋白同時存在時，才表現出最強的殺蚊活性［29］。

Bt伴胞晶體也存在類似的二元毒素，它們與Bs二元毒素有同源性，它們單獨存在時沒有毒性或毒性很低。這組又可以分為3類，分別為Cry36Aa（ET69）、Cry34／35和Cry48／49。

Cry36Aa（ET69）與Bs的二元毒素有較大的序列相似性，它可以單獨發揮毒力，所以并不算真正的二元毒素，該毒素對西方玉米根蟲有較弱的毒性［30］。

Cry34／35 包 括 從 Cry34Aa1／Cry35Aa1 到Cry34Ba3／Cry35Ba3共11對二元毒素。編碼二元毒素的基因同位于一個操縱子內部，分子量較小的Cry34毒素本身幾乎沒有毒性，較大的Cry35毒素對西方玉米根蟲有一定的毒力。兩種毒性同時存在時才能表現出完全的毒力［31］，Cry35Ab1部分片段與蓖麻毒素（ricin）部分片段有同源性。其毒理機制可能是在細胞膜形成孔洞。

Cry48／49 包 括 從 Cry48Aa1／Cry49Aa1 到Cry49Ab2／Cry49Aa4共5對二元毒素。它們實際上來源于Bs，嚴格來說不屬于Bt毒素。它們具有殺蚊活性并與Bt毒素有較高的同源性，如Cry48毒素與Bt具有殺蚊活性的Cry4Aa有33%的同源性，所以他們可能具有Bt毒素的3－結構域特征［32］，并將它們收錄在國際Btδ內毒素命名委員會的毒素系統中。

1.5 Cry6

目前有Cry6Aa和Cry6Ba兩個模式毒素，它們對線蟲具有毒殺活性。雖然已經發現Bt有多種毒素對線蟲具有毒殺活性，但Cry6毒素組與其他Bt毒素包括其他具有毒殺線蟲的毒素沒有序列同源性，沒有常見的5個保守序列區，但與許多其他Bt毒素一樣，Cry6A也含有一個小的活性核心［8］。Cry6Aa與其他Bt毒素同源性很小。研究發現，含Cry6A基因的轉基因番茄植株對根結線蟲具有更強的抵抗力，證實Bt毒素可以使植株對內部寄生線蟲具有抵抗力，并被認為具有控制轉基因植株內植物寄生線蟲的潛力［33］。由于Cry6的三維結構尚不清楚，目前對其毒殺線蟲的機制有待進一步研究。Marroguin等推測Cry5B毒素作用線蟲的機制可能與其作用于昆蟲的方式相似［32］，線蟲吞入的毒素與線蟲腸道內膜結合引起腸內膜滲透性增大，從而破壞了線蟲腸道組織使線蟲致死。但Cry5B屬于3－結構域毒素［35］，Cry6A和Cry5B兩種毒素對線蟲的作用方式存在著明顯的差異［36］。

1.6 Cry22

這一組毒素最先從對膜翅目具有毒殺作用的Bt菌株中分離得到，Cry22有3種模式毒素分別為Cry22Aa、Cry22Ab和Cry22Ba。Cry22Aa1對玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）有毒殺活性，Cry22Aa1和Cry22Aa2已經申請專利保護［37］。這一組毒素在序列上與其他毒素的同源性較小。X衍射晶體解析表明，Cry22Aa1為一個長條形6結構域蛋白，包括4個類鈣黏蛋白重復序列結構域和一個類似于3－結構域毒素結構域Ⅲ的C－端。但相關的資料未完全公開，其毒理機制未見報道。

1.7 抗癌伴胞素（parasporin）

Mizuki等于2000年通過對A1190Bt菌株的無殺蟲活性的毒素的研究［38］，首次發現該毒素存在抗癌活性并將其歸入Cry31Aa。抗癌伴胞素模式毒素包 括 Cry31Ab、Cry31Ac、Cry41Aa、Cry41Ab、Cry45Aa、Cry46Aa和Cry46Ab。目前已經成立了一個專門的抗癌伴胞素分類和命名委員會［39］。

Cry31Aal共有723個氨基酸殘基，分子量約為81ku，由長度為2 169bp的基因編碼。該蛋白存在3－結構域特征及5個氨基酸保守位點，當使用蛋白酶水解其N端后，產生了分子量分別為15、56ku的異二聚體蛋白，由此激活其抗癌活性。

Cry41Aa1和Cry31Aa1序列類似，存在較為典型的3個結構域且有5個保守序列。PS3Aa1共有825個氨基酸殘基，分子量約為94ku，同源性較其他Cry蛋白低，但其C端和血細胞凝集素HA－33的C端存在同源性，當其N端和C端同時被酶切后方能呈現出其抗癌活性［40］。

Cry45Aa1由275個氨基酸殘基構成，沒有其他Bt伴胞晶體毒素常見的5個保守位點，且與Cry15Aa有21%的同源性［41］。

Cry46Aal多肽鏈由338個氨基酸殘基組成。與PS1Aa1不同的是，盡管與其他Cry蛋白相比其序列同源性較低，但與Cry15Aal的同源性較高，而后者又與Bs的Mtx2和Mtx3具有較高的同源性。所以也可以把Cry46Aal放在類Mtx毒素組，由于Mtx毒素與產生的氣單胞菌溶素存在同源性，而后者的毒理機制是在細胞膜產生穿孔。所以推測Cry46Aal的毒理機制與成孔蛋白相似。與Cry31Aal類似，Cry46Aal也需要經過酶切才能顯示出其抗癌活性，但與前者不同的是，后者需在N端和C端同時酶切才能得到相應具有抗癌活性的片段［42］。

2 評論和展望

Bt是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性細菌，能夠在多種生態環境下生存，并在分類學表現出多種血清型和亞型［1］。伴胞晶體的結晶形態有多種，包括菱形晶體、方形晶體和雙金字塔等多種形態［3］。晶體的有無及大小形狀與毒力密切相關。更重要的是，雖然大部分伴胞晶體毒素的結構有3－結構域特征，但總體而言，伴胞晶體毒素從氨基酸殘基序列、殺蟲譜及三維結構特征上表現出高度的廣泛性，說明伴胞晶體毒素的結構和功能既具有很好的穩定性，同時又具有一定的進化性。由此也說明對伴胞晶體毒素的分類具有非常重要的意義。

將全部毒素分為Cry毒素和Cyt毒素兩大家族，這種劃分具有籠統性，基本上沒有考慮毒素的結構及其作用的靶標生物。后來有人根據靶標生物的特異性，將Bt Cry毒素分為6個大類（主要為系統命名中第一等級）［7］。這種劃分仍有局限性，弊端就在于有些毒素對兩三個目的害蟲具有毒殺活性。事實上毒素的毒力具有廣泛性。如已發現有些毒素具有抗癌活性［39］，有些毒素對膜翅目（Hymenoptera）、半翅目（Hemiptera）、蚤目（Siphonoptera）和扁形動物門棘口吸蟲目（Echinostomida）具有活性［2］。毒素的多樣性和進化性為我們發掘更多的毒素基因和發現毒素新的作用靶標生物打下了基礎。

國內已發現超過280種晶體毒素基因，并提交在國際Btδ內毒素命名委員會收錄［43－45］。隨著新的毒素基因不斷被克隆和發現，人們發現有些毒素序列相似，但其殺蟲活性不同，而某些毒素具有相同的殺蟲活性，其序列同源性卻又相差很大，所以以序列同源性和生物活性劃分類別的分類系統很難高度統一。目前普遍支持Crickmore提出的開放命名系統［5］，它為更多已知序列但其作用靶標生物未知的毒素找到了分類位置。但在這一分類系統的基礎上，根據毒素氨基酸序列、三維結構、靶標生物和殺蟲機理進一步分類是很有必要的，這對我們認識Bt毒素的多樣性和從分子水平上了解毒素作用模式具有十分重要的意義。

毒素從自然中來，與靶標生物之間的相互作用在進化過程已達到一個相當復雜的水平［46］。晶體毒素是一種致病毒力因子，靶標生物由此產生內部免疫機制。Bt作為一種昆蟲的病原物生物，其晶體毒素的毒力發揮需要多種因素的協同作用。隨著更多毒素及其作用受體的發現，晶體毒素與受體的互作機制必然呈現高度的復雜性，這又對我們進一步了解毒素的殺蟲機制提出了新的挑戰。

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