河南省五種常見禾本科雜草病原真菌種類調查與部分菌株的致病性測定

趙杏利， 牛永春， 鄧 暉

（農業部農業微生物資源收集與保藏重點實驗室／中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

禾本科、菊科、十字花科是雜草最集中的三大科，而且稗草、馬唐、狗尾草等禾本科雜草常伴生在水稻、大豆、小麥、玉米等主要農作物田中，危害很大［1］。近年來，隨著種植業結構的調整，肥水條件的變化，以及大面積長期使用除草劑，使得農田雜草的群落和結構發生了相應的變化，禾本科雜草危害日趨嚴重，嚴重影響了作物的產量和質量。利用從雜草病株分離篩選出來的植物病原菌防治雜草是開發新型生物除草劑的重要途徑。其中，有不少成功的例證，如中國的魯保一號，荷蘭的Biochon等［2］。對雜草病原真菌種類的調查將使我們了解雜草的病原真菌種類狀況、為利用雜草致病菌研發生物除草劑提供基礎和材料。潘麗梅等［3］調查了東北地區14科26屬雜草上的病原真菌，何偉等［4］調查了東北地區4種常見禾本科雜草上的病原真菌，楊葉等［5］調查了海南省17種雜草上的病原真菌。關于河南省雜草病原真菌種類的調查，張希福［6］鑒定了豫北地區19種雜草上的30種病原真菌，其中有5種病原真菌來自禾本科雜草；張猛等［7］從禾本科雜草上分離鑒定了9種蠕形分生孢子真菌，其中包括分別來自狗尾草、馬唐、狗牙根和牛筋草的5種平臍蠕孢屬真菌，分別來自馬唐和牛筋草的3種彎孢屬真菌，來自稗草的1種凸臍蠕孢屬真菌。對于這些真菌的致病性這兩篇報道中均未進行測定。本文針對河南省常見禾本科雜草，在對其真菌病害進行多地調查、采樣的基礎上，對所有病害樣本進行了分離鑒定，并對部分菌株進行了致病性測定。

1 材料和方法

1.1 病害調查

于2007年10月和2008年7月對河南省的信陽、南陽、洛陽、鞏義、三門峽、鄭州、開封、新鄉、焦作等地的農田和草坪中的狗尾草、馬唐、牛筋草、稗草、虎尾草5種常見禾本科雜草真菌病害的種類、癥狀及發生程度等進行調查。

1.2 樣本采集

調查過程中，對隨時采集的發病禾本科雜草的葉片和莖稈進行現場拍照，并記錄寄主名稱、采集地點、采集地生境、采集人姓名和采集日期及采集地坐標等信息。對于采集的樣本及時用吸水紙壓制使之盡快干燥。

1.3 病原真菌的分離

從發病部位的病健交界處切取5 mm2左右的組織塊，用0.1%升汞溶液進行表面消毒3 min，無菌水沖洗3次，移入PDA培養基平板上，26℃恒溫箱中培養。待菌落長出后，從組織塊菌落邊緣挑取少量菌絲，再次移入PDA平板上培養。經過移植純化，菌落形態和孢子形態均一致的菌株移入PDA斜面培養，保存備用。

1.4 病原真菌的鑒定

1.4.1 形態學鑒定

將菌株接種在PDA培養基平板上，26℃恒溫培養7 d，記錄菌落形態，觀察記錄孢子形態及產孢結構，測量孢子（30個）和孢子梗大小等，查閱專著文獻［8－10］進行鑒定。對在PDA平板上不易產孢的菌株，重新接種于水瓊脂培養基上，兩周后制作玻片進行顯微觀察。

1.4.2 DNA提取、r DNA ITS的PCR擴增及序列分析

在PDA平板上鋪一層玻璃紙，然后把供試菌株接種到玻璃紙上，待菌落接近長滿平板時從玻璃紙上收獲菌絲體，用SDS法提取基因組DNA［11］，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。

以提取的基因組DNA為模板，用引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）和 ITS5（5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′）［12］對供試菌株r DNA的ITS區域進行PCR擴增。反應液體積50μL，包括：10×PCR 緩沖液（p H 8.8 100 mmol／L Tris－HCl，500 mmol／L KCl，0.8%Nonidet P－40 5μL，25 mmol／L MgCl25μL，引物ITS4（10μmol／L）和ITS5（10μmol／L）各1μL，10 mmol／L d NTP 2μL，5 U／μLTaqDNA聚合酶0.4μL，基因組 DNA 1μL （1g／L），雙蒸滅菌水34.6μL。PCR反應程序：95℃預變性2 min后，95℃變性1 min，53℃復性1 min，72℃延伸2 min，進行34個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于溴化乙錠溶液（0.5μg／m L）中染色10 min，通過 ALPHA凝膠成像系統顯示記錄電泳結果。

PCR擴增產物經檢測后送到上海英駿生物技術有限公司測序，測序引物為ITS5。將測得的序列采用Blast程序與GenBank上的序列進行相似性比較。

1.5 致病性測定

1.5.1 孢子懸浮液的制備

選取樣品發病嚴重、在PDA培養基上易于產孢、且產孢量大的菌株，把各菌株分別接種在PDA平板上，于26℃恒溫培養箱中連續黑暗培養7～10 d，檢測產孢情況。待產孢較多時，加適量滅菌水于培養皿中，將菌落用玻片輕輕刮下，懸浮液經兩層滅菌紗布過濾，收集孢子懸浮液。將各菌株的孢子懸浮液分別調整至濃度為105個孢子／m L，加0.05%吐溫－80混勻待用。

1.5.2 供試植株的培育

將狗尾草、馬唐、牛筋草、稗草、虎尾草等植株較小的禾本科雜草播種于直徑7.5 cm的塑料花盆中，將小麥、玉米、高粱、谷子、棉花、番茄、黃瓜、大豆、花生等植株較大的作物播種于直徑15 cm的塑料花盆中。根據接種菌株的數量，按每菌株接種每種植物3盆準備供試植物。在溫度為20～30℃的溫室中培育植株，待長至2～4片真葉期，根據供試植物的植株大小每盆保留5～10株待用。

1.5.3 接種方法

采用孢子懸浮液噴霧法接種，用微型噴霧器將混勻的孢子懸浮液均勻噴灑到待接種的植株上，每個菌株接種供試植物3盆，每種供試植物留3盆噴含0.05%吐溫－80的無菌水作對照，共接種30個菌株。接種的植株置于密閉容器內室溫下保濕培養24 h，然后移到人工氣候箱中培養，每天光照12 h，光照度16500 lx，溫度32℃／25℃（光照／黑暗）、相對濕度（80±5）%。

1.5.4 病情調查

接種一周后調查發病情況，病情分級標準：NS，無癥狀；LS，有零星病斑；MS，病斑較大、較多；SS，病斑遍布植物葉片，病斑融合，植株死亡。

2 結果與分析

2.1 五種禾本科雜草上的真菌種類

狗尾草和馬唐在各調查地點分布普遍，葉和莖部發病很常見，局部發病嚴重，狗尾草上多為梭形褐斑，馬唐上多為近圓形褐斑。牛筋草、稗草在多數調查點都有分布，一般不成片發生，發病較輕，主要為條狀和不規則褐色葉斑。虎尾草一般局部成片發生，發病常見。共采集病害樣本72份，從中分離到152個菌株。共有131個菌株觀察到孢子，其中有82個菌株在PDA培養基上即可產孢，有49個菌株在PDA培養基上不產孢但在水瓊脂培養基上產生了孢子。經對產孢菌株的形態觀察和對70個菌株的ITS1－5.8S－ITS2序列分析，產孢菌株分屬于彎孢屬（Curvularia）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、凸臍蠕孢屬（Exserohilum）、莖點霉屬（Phoma）、鐮孢屬（Fusarium）、黑孢屬（Nigrospora）、枝孢屬（Cladosporium），炭疽菌屬（Colletotrichum）和鏈格孢屬（Alternaria）等9個屬。鏈格孢屬真菌數量最多，有61株；其次是平臍蠕孢屬和彎孢屬，分別有28株和27株；其他各屬真菌數量比較少。鑒定到種的真菌有16種，分子鑒定結果和形態學觀察結果相符合，與GenBank上相關種的序列相似性均在99%以上。其中平臍蠕孢屬真菌有5種：狗尾草平臍蠕孢［B.setariae（Saw.）Shoem.］、麥根腐平臍蠕孢［B.sorokiniana（Sacc.）Shoemaker］、甘蔗平臍蠕孢［B.sacchari（Butler）Shoem.］、玉蜀黍平臍蠕孢［B.maydis（Y.Nisik.＆ C.Miyake）Shoem］和多節平臍蠕孢［B.nodulosa（Berkeley et M.A.Curtis）Shoemaker］；彎孢屬真菌有3種：新月彎孢［Curvularialunata（Wakker）Boedijn］、間隔彎孢（C.intermediaBaedijn）和 香 茅 彎 孢 ［C.cymbopogonis（Dodge）Groves ＆Skolko］；凸臍蠕孢屬真菌有兩種：梭形凸臍蠕孢（E.fusiformeAloom）和嘴突凸臍蠕孢［E.rostratum（Dyechsler）K.S.Leonard ＆ Suggs］；鏈格孢屬真菌有兩種：密實鏈格孢［A.compacta（Cooke）Mcclellan］和 鏈格孢 ［A.alternata（Fr.）Keissl］（表1）。

除鏈格孢屬真菌在5種雜草上均能分離到外，其他真菌則只在1～3種雜草上分離到。其中新月彎孢僅在稗草上分離到，木賊鐮孢和多節平臍蠕孢僅在牛筋草上分離到，Phomasojicola、香茅彎孢和刺盤孢屬真菌僅在馬唐上分離到。除鏈格孢屬真菌在各雜草上出現的頻率較高外，稗草上的主要真菌為新月彎孢，狗尾草上的主要真菌為狗尾草平臍蠕孢，馬唐上的主要真菌為間隔彎孢、香茅彎孢，牛筋草上的主要真菌為多節平臍蠕孢（表1）。

表1 五種禾本科雜草上分離到的真菌種類和菌株數量Table 1 Species of fungi and number of strains isolated from 5 gramineous weeds

續表1 Table 1（Continued）

2.2 部分菌株的致病性

共對包括凸臍蠕孢屬4個菌株、彎孢屬7個菌株、枝孢屬1個菌株、平臍蠕孢屬11個菌株和鏈格孢屬7個菌株共30個菌株進行了致病性測定。結果表明，絕大部分菌株均能引起寄主不同程度發病。其中平臍蠕孢屬所有菌株均能引起狗尾草和虎尾草不同程度發病，狗尾草平臍蠕孢NY1菌株能引起狗尾草、馬唐、虎尾草嚴重發病，ZZ2和XY2菌株能引起狗尾草和虎尾草中度發病。梭形突臍蠕孢zxl07333b菌株能引起稗草中度發病，新月彎孢zxl07289a菌株能引起虎尾草嚴重發病和稗草中度發病，間隔彎孢zxl07251a菌株能引起馬唐和虎尾草中度發病，鏈格孢zxl07254b菌株能引起狗尾草和虎尾草中度發病，其余凸臍蠕孢屬、彎孢屬、枝孢屬和鏈格孢屬菌株在5種雜草上均只引起輕度發病或不引起發病（表2）。

對能引起雜草嚴重發病的狗尾草平臍蠕孢菌株NY1和新月彎孢菌株zxl07289a進行了初步寄主范圍測定，結果表明，兩個菌株在禾本科作物玉米、小麥和谷子上可引起一定程度發病，而在棉花、花生、大豆、黃瓜等雙子葉作物上則不引起任何病害。

表2 30個菌株對5種禾本科雜草的致病性測定1）Table 2 Pathogenicity of 30 isolates to 5 gramineous weeds

續表2 Table 2（Continued）

3 討論

蠕形分生孢子真菌是禾本科植物上的常見病原菌，主要包括平臍蠕孢屬（Bipolaris）、彎孢屬（Curvularia）、凸臍蠕孢屬（Exserohilum）、內臍蠕孢屬（Drechslera）和長蠕孢屬（Helminthosporium）［8］。何偉等［4］報道了東北地區狗尾草和馬唐上的主要病原菌分別為狗尾草平臍蠕孢和新月彎孢，稗草上的主要病原菌是新月彎孢、麥根腐平臍蠕孢和尖角凸臍蠕孢。本研究從河南5種禾本科雜草上分離到的病原真菌中，每種雜草的主要病原菌都屬于平臍蠕孢屬或彎孢屬，凸臍蠕孢屬真菌僅分離到7株，這可能與不同地理區域、不同生態環境條件下真菌的種類不同有關，而莖點霉屬、鐮孢屬、黑孢屬、枝孢屬和炭疽菌屬真菌都僅分離到零星菌株。關于分離自禾本科雜草的具有生防潛力的蠕形分生孢子真菌已有多篇報道，如狗尾草上分離到的狗尾草長蠕孢（Helminthosporiumsetariae）［6］和狗尾草平臍蠕孢（B.setariae）［13］，馬唐上分離到的多節長蠕孢（H.nodulosa）和（Drechsleragigantea）［14－15］，牛筋草上分離到的多節長蠕孢（H.nodulosa）［16］，稗草上分離到的禾長蠕孢稗草專化型（H.gramineumf.sp.echinochloae）和早熟禾內臍蠕孢（D.poae）［17－18］。作者等［13］的研究表明狗尾草平臍蠕孢（B.setariae）菌株NY1和新月彎孢（C.lunata）菌株zxl07289a對于禾本科雜草的生防潛力值得進一步研究。可見蠕形分生孢子真菌是狗尾草、馬唐、稗草等常見禾本科雜草上的主要病原菌，是具有禾本科雜草生防潛力的真菌種類。

據報道95%以上的鏈格孢屬（Alternaria）真菌屬于兼性寄生菌［19］。有的對寄主具有很強的致病作用，如水葫蘆鏈格孢（A.eichchorniae）和百日草鏈格孢（A.zinniae）［20－21］；有的往往侵染植物的衰老和受傷部位，或迅速搶占其他病原菌侵染造成的植物枯死病斑，如鏈格孢（A.alternata）和細極鏈格孢（A.tenuissima）［19］。本研究中對于7株鏈格孢進行了致病性測定，除1株A.alternata在4種供試禾本科雜草上均引起了明顯或較輕癥狀外，有5株均在1種供試禾本科雜草上產生了較輕癥狀。因此，可以推測本研究中分離到的鏈格孢菌株大部分都是禾本科雜草樣本上的病原真菌，不過其致病性一般較弱。

［1］丁建清.農田雜草的生物防治［J］.中國生物防治，1995，11（3）：129－133.

［2］Charudattan R.Biological control of weeds by means of plant pathogens：Significance for integrated weed management in modern agroecology［J］.BioControl，2001，46（2）：229－260.

［3］潘麗梅，白容霖，劉偉成，等.東北地區農田主要雜草的病原真菌及其地理分布［J］.吉林農業大學學報，2005，27（4）：373－377.

［4］何偉，鄧暉，牛永春，等.東北地區四種常見禾本科雜草病原真菌資源調查及其致病性測定［J］.植物保護，2011，37（1）：99－104.

［5］楊葉，劉美珍，孔祥義.海南常見雜草病原真菌資源調查及初步鑒定［J］.熱帶作物學報，2007，28（1）：85－89.

［6］張希福.豫北地區雜草植物病原菌資源調查［J］.中國生物防治，1996，12（3）：140－141.

［7］張猛，孫炳劍，劉建華.河南省禾本科農田雜草蠕形菌病原鑒定［J］.青島農業大學學報（自然科學版），2006，23（4）：300－302.

［8］張天宇.中國真菌志，第30卷，蠕形分生孢子真菌［M］.北京：科學出版社，2010.

［9］Sivanesan A.Graminicolous species ofBipolaris，Curvularia，Drechslera，Exserohilumand their teleomorphs［J］.Mycological Papers，1987，158：1－261.

［10］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，1979.

［11］Lee S B，Taylor J W.Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores［M］∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.San Diego：Academic Press，1990：282－287.

［12］White T J，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.San Diego：Academic Press，1990：315－322.

［13］趙杏利，鄧暉，牛永春.一種狗尾草病原真菌的鑒定及菌株致病性研究［J］.菌物學報，2010，29（2）：172－177.

［14］朱云枝，強勝.馬唐病原真菌的分離篩選及其致病力測定［J］.中國生物防治，2004，20（3）：206－210.

［15］Chandramohan S，Charudattan R.Control of seven grasses with a mixture of three fungal pathogens with restricted host ranges［J］.Biological Control，2001，22（3）：246－255.

［16］Figliola S S，Camper N D，Ridings W H.Potential biological control agents for goosegrass［J］.Weed Science，1988，36（6）：830－835.

［17］黃世文，余柳青，段桂芳，等.禾長蠕孢菌和尖角突臍孢菌防治稗草的研究［J］.植物病理學報，2005，35（1）：66－72.

［18］陳勇，倪漢文.中國稗草病原真菌對稗草及水稻的致病性［J］.中國生物防治，1999，15（2）：73－76.

［19］張天宇.中國真菌志，第16卷，鏈格孢屬［M］.北京：科學出版社，2003.

［20］趙國剛.水葫蘆致病菌的篩選及鏈格孢AlternariaeichchorniaeC416菌株的生物學特性［D］.北京：中國農業科學院，2000.

［21］李榮金.百日草鏈格孢菌毒素的生產、分離、純化和鑒定及其作為微生物源除草劑潛力的研究［D］.南京：南京農業大學，2005.