山東省蘋果輪紋病菌對三種三唑類殺菌劑的敏感性檢測

范 昆， 李曉軍， 張 勇， 王 濤， 李 軍， 曲健祿

（山東省果樹研究所，泰安 271000）

蘋果輪紋病（apple ring rot）是近年來蘋果生產上危害最為嚴重的一種病害，不僅可以危害枝干，造成樹勢衰弱、枝干枯死，還能造成大量爛果，發病嚴重時田間病果率可高達70%～80%，且貯藏期可持續發病［1－2］。近年來山東省蘋果種植區輪紋病發病率呈上升趨勢，給果農帶來嚴重的經濟損失。

蘋果輪紋病的病原菌為Botryosphaeriadothidea（Moug.ex Fr.）Ces.et de Not.，施用化學殺菌劑是目前防治蘋果輪紋病的有效措施之一，常用藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈等內吸性藥劑和代森錳鋅、福美雙等保護劑。由于生產上使用農藥品種較為單一，蘋果輪紋病菌已經產生了抗藥性［3－4］。馬志強，楊煒華等［5－6］檢測了蘋果輪紋病菌對多菌靈、甲基硫菌靈的抗藥性，均發現中低水平抗性菌株。三唑類殺菌劑自1973年被引入后廣泛用于各種病害的防治［7］，其中戊唑醇、苯醚甲環唑均已在蘋果樹病害防治中取得良好效果［8］，丙環唑正在田間推廣應用于防治蘋果輪紋病。本研究采用生長速率法，測定了山東省主要蘋果產區14株蘋果輪紋病菌對3種三唑類殺菌劑的敏感性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株的采集和分離

2007年8－10月，分別于棲霞、蓬萊、沂源、泰安、陽信等地相距一定距離的果園內，隨機采集輪紋病果，裝入干凈的小塑料袋中（每個袋子只裝一個標本），帶回實驗室分離純化獲得14個蘋果輪紋病菌株（Botryosphaeriadothidea）。

1.1.2 供試藥劑

95.8%苯醚甲環唑（difenoconazole）原藥，青島瀚生生物科技股份公司；96.4%丙環唑（propiconazole）原藥，青島瀚生生物科技股份公司；98%戊唑醇（tebuconazole）原粉，江蘇常隆化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養基的配制

先將戊唑醇、苯醚甲環唑、丙環唑原藥溶于丙酮中，配成10 000 mg／L的母液，置4℃冰箱中備用，測定時，根據培養基的用量，用移液槍吸取一定量的藥劑母液加入溶化并冷卻至50℃左右的培養基中，充分搖勻，配成含戊唑醇、苯醚甲環唑、丙環唑系列濃度的含藥培養基。每處理重復4次，以不加藥劑為對照。

1.2.2 蘋果輪紋病菌對供試藥劑的敏感性測定

在PDA平板上培養（26℃，黑暗）4 d的參試菌株菌落邊緣打出直徑7 mm的菌餅，分別移到含有戊唑醇、苯醚甲環唑、丙環唑6個梯度濃度（戊唑醇：1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.032μg／m L；苯醚甲環 唑：0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6μg／m L；丙環唑：0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025μg／m L）的PDA平板上，置26℃暗培養4 d，測定菌落徑向線性生長量，確定藥劑對菌落生長的抑制率。每處理（每菌株每濃度水平）重復4次。

抑制生長率（%）＝［（對照菌落直徑 －處理菌落直徑）／（對照菌落直徑 －菌餅直徑）］×100。

1.3 數據處理

試驗數據均由Microsoft Excel 2003、DPS數據處理工作平臺進行統計分析。

通過菌絲生長抑制概率值和藥劑濃度對數值之間的線性回歸分析，求出各藥劑對各供試蘋果輪紋病菌菌株的有效抑制中濃度（EC50值）［9－10］，用 DPS對供試菌株EC50值的離差平方和進行系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同地理來源菌株對3種藥劑的敏感性

蘋果輪紋病菌對3種藥劑的敏感性測定結果（表1）表明，苯醚甲環唑對14個菌株的EC50值在0.011 1～0.125 1μg／mL之間，平均值為（0.059 9±0.010 7）μg／mL，最高值約為最低值的11.27倍；丙環唑對14個菌株的EC50值在0.040 8～0.295 5μg／mL之間，平均值為（0.144 3±0.021 4）μg／mL，最高值約為最低值的7.24倍；戊唑醇對14個菌株的EC50值在0.086 8～0.578 3μg／mL之間，平均值為（0.217 2±0.037 7）μg／mL，其中菌株QX02的EC50值最大，TA01的EC50值最小，為最敏感菌株，前者的EC50值是后者的6.66倍。

表1 三種藥劑對蘋果輪紋病菌菌株的EC50值比較1）Table 1 The EC50 values of three fungicides against Botryosphaeria dothidea

續表1 Table 1（Continued）

采用Duncan氏新復極差法檢驗3種藥劑對14個菌株EC50值的差異顯著性。苯醚甲環唑對各菌株的EC50值除菌株PL01與QX01之間無顯著差異外，其他菌株之間均存在極顯著差異；丙環唑對各菌株的EC50值除菌株TA03與YY02之間無顯著差異外，其他菌株之間均呈極顯著差異；而戊唑醇對所有菌株的EC50值均存在極顯著差異。

2.2 蘋果輪紋病菌對3種藥劑敏感性水平的系統聚類分析

2.2.1 供試菌株對苯醚甲環唑的敏感性水平

苯醚甲環唑對供試菌株EC50值的離差平方和系統聚類分析結果表明，14個菌株的EC50值由高到低可分為3個聚類組，第1組有5個菌株（YY03、PL02、QX03、TA02、PL03），第2組包括4個菌株（YY02、QX01、PL01、YX02），第3組包括5個菌株（YY01、TA03、QX02、YX01、TA01）。所有聚類組都包括不同的菌株系列，YY、QX系列內的3個菌株在3個聚類組中均有出現，PL、TA系列內的3個菌株出現在2個聚類組中，含兩個菌株的YX系列分別出現在2個聚類組中（圖1）。說明蘋果輪紋病菌對苯醚甲環唑離體敏感性的差異和菌株的行政區域來源沒有明顯相關性，但同一地區不同菌株間的敏感性差異較大。

圖1 苯醚甲環唑對蘋果輪紋病菌EC50值的系統聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the EC50 values of difenoconazole against B.dothidea

2.2.2 供試菌株對丙環唑的敏感性水平

統計分析結果表明，丙環唑對14個菌株的EC50值由高到低可分為3個聚類組，第1組僅1個菌株（QX03），第2組包括6個菌株（PL03、QX02、PL02、QX01、YY01、PL01），第3組包括7個菌株（YY03、YX02、TA03、YY02、TA02、TA01、YX01）。其中QX03自成一組，EC50值最大，敏感性水平最低，其他聚類組均包括不同的菌株系列，表明各供試蘋果輪紋病菌對丙環唑的離體敏感性差異不明顯。

圖2 丙環唑對蘋果輪紋病菌EC50值的系統聚類分析Fig.2 Cluster analysis of the EC50 values of propiconazole against B.dothidea

2.2.3 供試菌株對戊唑醇的敏感性水平

戊唑醇對蘋果輪紋病菌EC50值的離差平方和系統聚類分析結果表明，14個菌株的EC50值由高到低分為3個聚類組，第1組3個菌株（QX02、YX02、YY02），第2組包括5個菌株（TA03、YY03、QX01、YY01、PL02），第3組包括6個菌株（TA02、YX01、PL03、QX03、PL01、TA01）。3個聚類組均包括不同的菌株系列，QX系列內的3個菌株在3個聚類組中均有出現，YY、PL、TA系列內的3個菌株出現在2個聚類組中，含兩個菌株的YX系列分別出現在2個聚類組中（圖3）。說明蘋果輪紋病菌對戊唑醇離體敏感性的差異和菌株的行政區域來源沒有明顯相關性，但同一地區不同菌株間的敏感性差異較大。

圖3 戊唑醇對蘋果輪紋病菌EC50值的系統聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the EC50 values of tebuconazole against B.dothidea

3 結論與討論

本研究結果顯示，各供試蘋果輪紋病菌菌株對各藥劑的敏感性均存在不同程度的差異。苯醚甲環唑、丙環唑和戊唑醇對山東省主要蘋果種植區的14個菌株的EC50值分別在0.011 1～0.125 1μg／mL［平均值（0.059 9±0.010 7）μg／m L］、0.040 8～0.295 5μg／m L［平均值（0.144 3±0.021 4）μg／m L］、0.086 8～0.578 3μg／mL［平均值（0.217 2±0.037 7）μg／m L］之間。菌株YY03對苯醚甲環唑的敏感性較低，EC50是TA 01菌株EC50的11.27倍；菌株QX03對丙環唑的敏感性較低，EC50是YX01菌株EC50的7.24倍；菌株QX02對戊唑醇的敏感性較低，EC50是TA01菌株EC50的6.66倍。通過Duncan氏新復極差法和系統聚類分析結果表明，供試菌株之間對三唑類殺菌劑的敏感性差異較大。究其原因，其一可能與自然界病原菌本身的生理差異有關；其二，在蘋果樹生長期，三唑類藥劑還被廣泛應用于防治蘋果斑點落葉病、蘋果褐斑病等葉部病害，而各地使用的三唑類殺菌劑的種類和頻率不盡相同，從而導致蘋果輪紋病菌對這3種藥劑的敏感性不同。

利用化學農藥防治植物病害是植物病害綜合防治措施之一，目前山東省各蘋果主產區防治蘋果輪紋病主要以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑為主，但因其高抗藥風險性，病原菌極易產生抗性而使其防效降低［5］。國外對苯并咪唑類殺菌劑引起植物病原菌產生抗藥性的報道很多［4，11－13］，在我國河北保定關于蘋果輪紋病菌對多菌靈的抗藥性也有相關報道［5］。三唑類殺菌劑是新一代高效、廣譜、內吸、低毒殺菌劑，對谷物、果樹、蔬菜及重要的經濟作物由子囊菌、擔子菌和半知菌引起的重要病害具有極好的治療和鏟除作用［14］。周增強［15］、蘇平［8］等報道，戊唑醇對蘋果輪紋病防治效果好且使用安全，本研究證明，三唑類殺菌劑對蘋果輪紋病菌的抑制效果較好，表明該類藥劑在蘋果輪紋病防治中具有較大應用潛力。

本研究測定了蘋果輪紋病菌在離體條件下對3種三唑類殺菌劑的敏感性水平，發現大部分菌株處在較高敏感水平，僅菌株TA01對苯醚甲環唑的敏感性較低，說明蘋果輪紋病菌對三唑類殺菌劑存在一定的抗性風險，鑒于此，蘋果輪紋病菌對3種藥劑的抗性風險評價正在研究中。建議在推廣中繼續加強該菌的敏感性監測，通過合理使用藥劑，防止或延緩病菌對三唑類殺菌劑產生抗性。

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