高速逆流色譜在手性拆分中的應(yīng)用

黃林兵

（浙江省天正設(shè)計(jì)工程有限公司，浙江 杭州 310012）

高速逆流色譜 (high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相的分離方法。由于不需要固體支撐體，物質(zhì)依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而分離，因而解決了傳統(tǒng)分離色譜因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等問題。由于這個(gè)特點(diǎn)，高速逆流色譜特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。

1 HSCCC技術(shù)

1.1 HSCCC發(fā)展過程

上世紀(jì)50年代，逆流分溶法（countercurrent distribution,CCD）被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離。但是由于裝置固有的一些缺陷，比如設(shè)備龐大復(fù)雜，易碎，溶劑體系容易乳化，溶劑消耗量大和分離時(shí)間太長等，很快在20世紀(jì)60年代被液相色譜淘汰。

在20世紀(jì)70年代，一種結(jié)合了逆流分溶和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)的方法，逆流色譜（countercurrent chromatography,CCC）法被用來進(jìn)行連續(xù)的逆流分離。基于這種方法的液滴逆流色譜在1972年被商業(yè)化，并在20世紀(jì)七八十年代被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離。但是這種裝置所需分離時(shí)間較長，通常要2～3 d，并且僅有有限的溶劑體系可以使用，且清洗較困難，在很多連接處容易出現(xiàn)滲漏，因此在20世紀(jì)70年代末，讓位于其他新型逆流色譜技術(shù)。

在20世紀(jì)七八十年代，Ito教授研制出一種高效的逆流色譜系統(tǒng)，也就是現(xiàn)在的高速逆流色譜，可以在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效的分離，在高速旋轉(zhuǎn)和分離過程中不易出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象。

高速逆流色譜的目的主要是制備型分離，目前已被廣泛應(yīng)用于植物中生物堿類，黃酮類，萜類等物質(zhì)的分離提取制備[1-3]，并在金屬離子分離方面也有應(yīng)用[4]。

1.2 HSCCC優(yōu)點(diǎn)

1)避免了樣品在分離過程的不可逆吸附、分解等可能的樣品變性問題。

2)滯留在柱中的樣品可以通過多種洗脫方式予以完全回收。

3)粗樣可以直接上樣而不會對柱子造成任何損害。

4)柱子可以用合適的溶劑很容易的清洗，用空氣或氮?dú)飧稍铮缓笞⑷胄碌娜軇┖髽?gòu)成新的柱體，可重復(fù)使用。

5)通過改變?nèi)軇w系，實(shí)現(xiàn)對不同記性物質(zhì)的分離。

6)被分離組分在柱中保留時(shí)間或保留體積，可以通過其分配系數(shù)進(jìn)行預(yù)測。

7)HSCCC的制備量可以比HPLC大，而且費(fèi)用低，因?yàn)槠洳恍枰嘿F的色譜柱。

1.3 兩相溶劑體系選擇

高速逆流色譜發(fā)明人，美國國立衛(wèi)生院Ito[5]教授針對高速逆流色譜的溶劑選擇提出了8條原則。

1)在前人的研究中尋找已經(jīng)被應(yīng)用于相似物質(zhì)分離的溶劑體系。

高速逆流色譜使用由互不相溶的溶液組成的兩相溶劑體系，一相作為固定相，一相作為流動相。由于兩相溶劑體系可以有多種任意的組成，這就導(dǎo)致了溶劑選擇的困難。所以首先要查閱前人的工作，尋找類似的已經(jīng)成功應(yīng)用的溶劑體系，這樣可以節(jié)約時(shí)間和經(jīng)歷。

如果沒有找到合適的溶劑體系，那么在通過實(shí)驗(yàn)確定溶劑體系時(shí)，需要注意，分析物要在系統(tǒng)中可溶并且穩(wěn)定；溶劑體系應(yīng)由兩相以合適的體積比形成，以避免溶劑浪費(fèi)；分析物應(yīng)在兩相中有合適的分配系數(shù)；溶劑體系可以在柱中產(chǎn)生合適的固定相保留值。

2)尋找分析物分配系數(shù)K在0.5～1之間的體系。

過小的分配系數(shù)K會導(dǎo)致大部分溶質(zhì)都在溶劑前端，引起過小的解析率；過大的分配系數(shù)K會產(chǎn)生較寬的峰型，并且洗提時(shí)間也會增大。

3)根據(jù)兩相溶劑體系中油相的疏水性，系統(tǒng)性的尋找合適的溶劑體系。

如果目標(biāo)產(chǎn)物的極性并不明確，可以從中等極性的溶劑體系，比如庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比 3∶5∶3∶5）開始嘗試。如果目標(biāo)產(chǎn)物是親脂性的，那么就要選擇疏水性的溶劑體系，比如庚烷-甲醇-水（體積比 10 ∶5 ∶5）；相應(yīng)的，如果目標(biāo)產(chǎn)物是親水性的，則需選擇極性溶劑體系，比如丁醇-水（體積比 5 ∶5）。

表1 高速逆流色譜常見溶劑體系及其極性Table 1 Choice of the solvent system and its polar

4)當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物是羧酸類電負(fù)性物質(zhì)，需要在溶劑系統(tǒng)中添加酸性物質(zhì)來調(diào)節(jié)分配系數(shù)。

5)在分離兩種類似物質(zhì)時(shí)，兩種物質(zhì)的分配系數(shù)比，也就是分離因子要大于1.5。

6)可以通過分配系數(shù)的值來估計(jì)分離目標(biāo)產(chǎn)物所需的溶劑體積。

當(dāng)分配系數(shù)K為1時(shí)，洗提體積與柱體積是一致的；當(dāng)分配系數(shù)大于1時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物在洗提體積大于柱體積時(shí)出現(xiàn)；當(dāng)分配系數(shù)小于1時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物在洗提體積小于柱體積時(shí)出現(xiàn)。

7)固定相保留值越大，則峰解析率越好。

8)需要提前測量溶劑體系分為兩相的時(shí)間。

如果溶劑體系可以在20 s內(nèi)分為兩相，則這種系統(tǒng)可以提供超過50%的固定相保留值。

9)樣品溶液要與溶劑體系中的每一項(xiàng)都可形成兩相。

當(dāng)樣品只溶于固定相中，則需在固定相中添加一定量的流動相，直至形成兩相。當(dāng)大量溶質(zhì)溶解在兩相溶液中時(shí)，由于相組成的改變，樣品溶液可能會變成單一的均相，這時(shí)就需要加入大量的固定相或者流動相，直至重新出現(xiàn)兩相。

一些常見的溶劑體系及其極性列在表1中。

針對手性拆分，也有一些特定的原則需要滿足，手性選擇劑需要在一相或者兩相中可溶；消旋體應(yīng)在兩相中均可溶；消旋體的分配系數(shù)應(yīng)在1 左右[6]。

2 高速逆流色譜在手性拆分方面的進(jìn)展

手性分離技術(shù)已經(jīng)在高效液相色譜，氣相色譜和毛細(xì)管電泳中得到廣泛應(yīng)用[7-8]，但在逆流色譜中應(yīng)用很少。主要困難在于尋找合適的手性選擇劑，它們在液相和混合溶劑中都要有很高的選擇性，并且能將所要分離的手性異構(gòu)體洗脫出。盡管進(jìn)展不大，但還是有一些文獻(xiàn)報(bào)道，將高速逆流色譜應(yīng)用于手性拆分，如表2所示。

Shengqiang Tong[9]通過添加羥丙基-β-環(huán)糊精手性拆分甲氧萘丙酸，對比研究了9種溶劑系統(tǒng)以及8種水相pH對手性選擇性和分配系數(shù)的影響，最終篩選出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)操作條件，并且制備出的單體純度超過99.5%。最終回收的藥品回收率達(dá)到89%。該工作組的成員[10]同樣利用羥丙基-β-環(huán)糊精作為手性拆分劑，成功拆分了單體純度超過98.5%，回收率超過82%的苯基琥珀酸。同時(shí)其還提出了一種新型分離方法——兩相識別技術(shù)[6]，即在固定相和流動相中分別加入不同的親脂和親水的手性選擇劑，對外消旋體進(jìn)行手性拆分，他們在固定相中加入親脂的(-)-2-乙基己基酒石酸，流動相加入親水的羥丙基-β-環(huán)糊精，成功拆分出純度達(dá)到99.5%的單體。

Perez[11]利用L-脯氨酸和4R-羥基-L-脯氨酸衍生物作為手性選擇劑，通過優(yōu)化溶劑體系，手性選擇劑濃度，水相pH等實(shí)驗(yàn)操作條件，成功拆分了分離N-(3,5)-二硝基苯甲酰-亮氨酸和苯酮苯丙酸。Perez[12]也利用纖維素和淀粉糖3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯，成功拆分出純度為84%的心得樂和殺鼠靈。隨著研究進(jìn)一步發(fā)展，他們又分別利用[13]N-十二烷基-L-脯氨酸-3,5-二甲基苯胺和2-甲烷氧基乙基-L-脯氨酸-3,5-二甲基苯胺作為手性拆分劑，成功對亮氨酸進(jìn)行了手性拆分。

表2 高速逆流色譜在手性拆分中的應(yīng)用Table 2 The HSCCC in chrial separation

從表2可看出，目前常用的手性拆分劑是酒石酸及β-環(huán)糊精衍生物，以及一些天然蛋白質(zhì)，這些手性拆分試劑均是在高效液相色譜，或者毛細(xì)管電泳中表現(xiàn)出良好的手性拆分性能，為了進(jìn)一步提高拆分效率，減少拆分時(shí)間，這些已經(jīng)在其他方法中被驗(yàn)證可行的手性拆分劑被用于高速逆流色譜中，并表現(xiàn)出優(yōu)異的手性拆分性能。

高速逆流色譜在手性拆分上還有很大的發(fā)展空間，仍需進(jìn)一步尋找新型手性拆分試劑，溶劑體系等，從而提高高速逆流色譜的應(yīng)用范圍。

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