小鼠血管內皮細胞的培養、鑒定及巨噬細胞移動抑制因子對其促增殖作用的研究

段朝霞，陳魁君，張潔元，李兵倉，王建民

血管內皮細胞(VEC)由一層扁平細胞所組成，呈單層連續性襯在血管內面，形成血管的內壁。在炎癥反應、損傷及免疫應答等多種病理生理過程中發揮作用。VEC功能的異常與血栓形成、動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病、免疫疾病及腫瘤擴散都有密切關系［1］。為了對內皮細胞的功能有更多了解，研究者不斷地對人及動物內皮細胞的原代培養方法進行探索。本文參照文獻報道的培養方法［2-3］，探索簡單易行的小鼠VEC的培養及鑒定方法，并研究巨噬細胞移動抑制因子(MIF)對VEC增殖活性的影響，為深入研究VEC的相關作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗動物為清潔級6～8周齡C57B6小鼠5只，雌雄不限，體質量18～25 g。由第三軍醫大學第三附屬醫院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 高糖DMEM培養基、胎牛血清(FBS)為 Gibco產品，內皮細胞生長添加劑(ECGS)為 Sigma公司產品，大鼠抗小鼠 CD31/CD144抗體為BD公司產品，基質膠(MatrigelMatrix)購于BD公司，大鼠抗小鼠CD146免疫磁珠、MPC-S型磁架為Dynal公司產品，胰酶為Invitrogen產品，小鼠重組 MIF及抑制劑［(S，R)-3-4-羥苯-4，5-二氫-5-異口惡唑乙酸甲酯］(ISO-1)為 Sigma公司產品，甲基噻唑基四唑(MTT)試劑盒為Sigma公司產品。倒置相差顯微鏡(Olympus)、熒光顯微鏡(Leica)、酶標儀(Thermo labsysytems)。

1.3 方法

1.3.1 抗體磁珠的預處理:首先將50 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于50 ml磷酸緩沖液(PBS)中制成0.1%BSA/PBS的磁珠沖洗緩沖液，用0．22 μm 濾器無菌處理后4℃保存;在超凈工作臺內取100 μl抗CD146免疫磁珠于1 ml磁珠沖洗緩沖液，置于磁架上，1 min后移去上清液，重復沖洗4次;用磁珠沖洗緩沖液再懸浮磁珠至最初的容積，每100 μl磁珠加入10 μl(5 μg)抗體，置于旋轉混勻機混勻，4℃孵育過夜或室溫孵育2 h;于磁架上用磁珠沖洗緩沖液沖洗4次后，再用磁珠沖洗緩沖液再懸浮磁珠抗體至最初的容積，于4℃條件下可保存1個月。

1.3.2 細胞的制備:實驗前1天將基質膠放入4℃條件下過夜，使其溶化;加入血管環之前15 min，在12孔板內加入1．0 ml基質膠(保證底部鋪滿即可)，放入37℃培養箱內使其凝固。用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉小鼠后，用75%乙醇消毒5 min，無菌條件下打開腹腔和胸腔，游離主動脈，取髂總動脈分支平面到降主動脈段的動脈，置于裝有冰D-Hanks液的一次性組織培養皿內，用無菌注射器吸取D-Hanks液沖洗血管環;然后將血管環移入另一個裝有冰D-Hanks液的一次性組織培養皿內，在解剖顯微鏡下剝去血管環周圍的脂肪及結締組織;再將分離的組織置于直徑100 mm的一次性組織培養皿中。在解剖顯微鏡下將血管環剪成0．5 mm長短后放入預先加了基質膠的12孔培養板內，每孔放2或3節，孔內再加基質膠，覆蓋血管環，放入37℃培養箱內15 min使其凝固，在培養孔內加入內皮細胞培養基(含 20%FBS、75 μg/ml ECGS，50 μg/ml肝素、200 U/ml青霉素、0．2 μg/ml鏈霉素的DMEM)。將培養板置于5%CO2、37℃培養箱中進行培養，待細胞長至80%～90%融合時，采用胰酶消化法進行傳代培養。

1.3.3 單細胞懸液的制備:細胞達到80%～90%融合時進行胰酶消化收集細胞。吸掉培養基，以少許0．25%胰酶溶液潤洗1遍，吸掉潤洗液，加入0.25%胰酶溶液，完全蓋住細胞即可，置于37℃培養箱中進行消化并計時，相差顯微鏡下觀察消化狀態，以細胞收縮變圓，細胞間有明顯間隙為消化完全，輕輕拍打培養皿邊沿使細胞分散開，立即加入3～4 ml含血清的培養液終止消化，混勻制成單細胞懸液，備純化用。

1.3.4 免疫磁珠的分離:嚴格按照試劑盒說明書操作。每1 ml細胞懸液加入15 μl抗CD146免疫磁珠，置于旋轉混勻機4℃孵育20 min;將EP管置于磁架2 min。吸附細胞的磁珠和無細胞吸附的磁珠將被分至EP管的兩極;無需移動EP管，將上清液移出，從磁架上取下EP管，各加入1 ml冰基礎培養基重懸磁珠團粒;將EP管再置于磁架上2 min，小心地吸出上清;重復沖洗至少4次，直至上清液變得清澈;各加入1 ml內皮細胞培養重懸磁珠團粒，收集純化細胞計數并鑒定純度，然后將其余細胞按104接種至0．1%明膠涂層的96孔板或10 cm培養皿內，加入適量的完全培養基;放入5%CO2培養箱孵育過夜，移除未貼壁細胞，已貼壁細胞用D-Hanks液沖洗2次后加入適量完全培養基;隔日換液。

1.3.5 細胞的鑒定:采用抗CD31抗體進行VEC的免疫組化鑒定，同時用Hoechst 33342標記細胞核。用摔片機將經抗CD146免疫磁珠純化后的細胞集中在玻片上，每張玻片約1000個細胞，然后將細胞標本用新鮮配制的4%多聚甲醛固定10 min;PBS漂洗3次，每次5 min;用山羊血清或1%BSA室溫下孵育30～60 min;加入大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜或37℃孵育3 h，PBS漂洗3次，每次5 min;加入PE標記的山兔抗大鼠IgG(1∶50)二抗混合工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;5 μg/ml的 Hoechst 33342工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;玻片自然干后，用封片劑封片，防止熒光淬滅;在熒光顯微鏡下隨機選擇9個視野，相應激發光下分別觀察CD31抗體及Hoechst 33342染色結果。

1.3.6 細胞增殖的測定:用MTT試劑盒檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。將細胞按104/孔種植于96孔板，待細胞70%～80%融合時按是否加入不同濃度的MIF或MIF拮抗劑ISO-1，分為空白對照組(8孔)、MIF組(40孔)、ISO-1組(24孔)。繼續培養48 h后，每孔加10 μl MTT試劑，輕輕混合均勻后，將培養板放于37℃條件下孵育3 h，孵育結束后，96孔板底部可見黑色顆粒狀物質;輕輕吸掉上層液體，注意不要將黑色顆粒吸出;每孔加入100 μl顆粒溶解液，混勻后成用酶標儀在570 nm處測吸光度(OD)值。MIF 用 5、25、50、100、200 ng/ml 5 個濃度，ISO-1 用100、250、500 μmol/L 3 個梯度，每個濃度用8孔。

1.4 統計學處理 應用SPSS 11．0統計軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 VEC形態 原代培養4～6 d，在動脈血管環附近可見少量的細胞遷出并貼壁生長，細胞呈短梭形或多角形，細胞邊界清楚，體積較大，胞漿豐富，核呈橢圓形。培養9～14 d，遷移出的細胞覆蓋培養孔面積的2/3以上，密度不勻，其中約80%的細胞匯合成多層，單層呈現內皮細胞典型的“鵝卵石”樣特征。見圖1。

圖1 原代培養小鼠主動脈內皮細胞鏡下形態(×100)

2.2 細胞鑒定 純化細胞經免疫組化后在熒光顯微鏡下檢測結果顯示，細胞純度均在95%以上，見圖2。由于未經過培養的細胞直接用摔片機摔到玻片上的，因此免疫組化結果顯示無明顯的細胞形態。

圖2 熒光顯微鏡下小鼠主動脈內皮細胞CD31(免疫熒光染色 ×100)

2.3 MIF對VEC增殖的影響 低劑量MIF能顯著促進VEC的增殖，并具有劑量效應關系，而高劑量MIF及MIF的抑制劑ISO-1能顯著抑制VEC的增殖，ISO-1的抑制增殖作用也具有劑量效應關系。見表1。

表1 不同濃度MIF及ISO-1促進主動脈VEC增殖的情況

3 討論

國內外開展VEC的原代培養已多年，方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法;鑒定方法多用細胞形態學結合免疫組化染色AgⅧ相關抗原、流式細胞儀檢測CD31表達等［4-7］。上述2種VEC原代培養方法雖然步驟簡單、經濟易行，但是存在成纖維細胞等雜細胞干擾的缺點，即便使用差速貼壁和分次消化的方法也不能完全去除雜細胞，從而使其實用性受限。本實驗選擇酶消化法結合免疫磁珠法分選，并結合實驗室的條件，反復摸索，在國內外文獻報道的VEC培養方法上加以改進，可快速、簡便地分離、純化、體外培養和鑒定小鼠VEC。結果顯示，成功分離并體外擴增出小鼠VEC，克服了雜細胞的干擾。實驗成功的關鍵在于:抗體磁珠預處理時充分清洗(不少于4次)，盡量去除疊氮鈉(NaN3)以減少其對細胞的不良影響;取動脈環及分離時盡量在冰DHanks液中操作，以保證細胞的活性;胰酶消化時，最好每隔幾分鐘放于顯微鏡下觀察一次，完全消化后及時終止消化，一般總消化時間不能超過20 min，以免損傷細胞影響貼壁;抗體與磁珠作用及細胞與抗體磁珠作用時保持4℃環境，以確?？贵w活性，并降低細胞代謝，從而保證分選效率和細胞活性。

MIF從被發現至今已40多年，研究者對它的認識逐漸全面、深刻。MIF作為淋巴細胞因子被發現并一度被認為只有活化的T淋巴細胞才能產生MIF，現在發現腦垂體前葉、單核(巨噬)細胞、表皮細胞、腎小管上皮細胞、肝細胞、VEC和平滑肌細胞等也產生MIF［8］。MIF除作為淋巴細胞因子外，還是一種重要的促炎因子，能夠對抗糖皮質激素的抗炎作用，調節細胞增殖、抑制細胞凋亡，是參與腫瘤形成和血管發生的重要因子［9-11］。經實驗證明，天然MIF和重組MIF同樣具有互變異構酶的活性。ISO-1為選擇性MIF互變異構酶抑制劑的一種，通過特異性結合MIF的D型多巴色素互變異構酶活性位點，抑制該酶活性并阻止MIF結合其他細胞間信號轉導分子，從而抑制MIF的功能活性［12］。大量研究證實，MIF能促進多種細胞如大腸癌細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞、心肌細胞等的增殖;而MIF的抑制劑ISO-1可抑制這些細胞的增殖及相應的功能活性［13-16］。本研究初步證實，低劑量MIF可以促進VEC增殖，并具有劑量效應關系。高濃度MIF卻不具有促進細胞增殖的作用，反而抑制細胞的增殖，這與其他文獻報道的結果不一致。筆者查閱大量的文獻，發現很少的文獻做MIF促細胞增殖的量效關系研究，大多數直接采用低濃度(10 ng/ml)的MIF做增殖實驗。有研究證實，MIF在50～100 ng/ml時的活性達到最佳［17］，與本實驗結果一致高濃度MIF抑制細胞增殖的原因有待于進一步明確。

本研究結果初步證實，低濃度的MIF能促進原代培養的VEC增殖，說明MIF在血管發生及其他血管類病變中起重要作用，也可能通過促進血管生成來加強腫瘤的浸潤轉移，但其具體機制有待于進一步研究證實。

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