黃芪藥材高效液相色譜－二級管陣列檢測法指紋圖譜的色譜柱評價研究

王 敏，王逢春，郝影霞，李 翔

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．var．mongholicus(Bge．)Hsiao或膜莢黃芪 Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．的干燥根，主要有效成分為皂苷和黃酮類化合物，其具有清除氧自由基，抑制脂質過氧化和維持血中NO濃度，保護缺血再灌注損傷等多種藥理活性［1-3］。目前，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜在黃芪藥材質量評價中的研究已經逐步深入，發揮了重要的作用。前期的研究發現，盡管采用相同的色譜條件和方法，不同的色譜柱會使得到的HPLC指紋圖譜產生一定的差異，也將會影響相似度的計算結果［4-7］。目前，針對色譜柱在HPLC指紋圖譜研究的作用及相應的評價開展較少，尚未形成系統的研究理論和有效的評價方法，故有待于進一步的研究［8-9］。為保證色譜條件具有更好的耐用性和穩定性，參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》的相關規定，對黃芪藥材高效液相色譜－二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)指紋圖譜所采用的色譜柱進行考察，并結合統計學方法對相似度計算結果進行分析評價，以更好地保證黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜的適用性和穩定性，提高黃芪藥材指紋圖譜的評價能力。現報告如下。

1 儀器和試藥

Dionex高效液相色譜儀:P680 Pump泵，PDA-100二極管陣列紫外檢測器，Dionex Chromeleon工作站，TCC-100柱溫箱，ASI-100自動進樣器;上海淀久DJ-04藥材粉碎機;METTLER AE240電子天平;CQF-I-6型超聲儀。黃芪藥材由上海華宇藥業有限公司GAP試驗基地提供并鑒定為膜莢黃芪的干燥根。甲醇和乙腈為色譜純;水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:A柱:依利特 Hypersil ODS 2 柱 (4．6 mm × 250 mm，5 μm，柱 號:E1417176);B 柱:漢邦 Lichrospher C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm，柱號:03201255);C 柱:迪馬 DiamonsilTMC18柱(4．6mm ×250 mm，5 μm，柱號:99903);流動相:A相為乙腈－甲醇(體積比9∶1)，B相為水，梯度洗脫。A相含量隨時間的變化:5%(0～5 min)，5%～20%(5～8 min)，20%(8～15 min)，20%～30%(15～18 min)，30%～45%(18～35 min)，45%～80%(35～38 min)，80%～95%(38～60 min);流速 1．0 ml/min;柱溫為室溫;檢測波長260 nm;進樣量20 μl，進樣前以流動相梯度初始條件平衡15 min。

2.1 樣品溶液的制備 取藥材粗粉2．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 ml，超聲處理20 min，濾過，濾渣用甲醇洗滌3次，每次20 ml，合并濾液減壓回收溶劑，轉移至5 ml量瓶中，定容，搖勻，0．45 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得，置于4℃冰箱保存。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性試驗:將黃芪藥材樣品溶液分別在0、3、6、12、24、48 h 進樣檢測，考察樣品溶液的穩定性。結果表明，色譜峰的相對保留時間、相對峰面積精密度(RSD)均＜2．7%，表明樣品溶液在48 h內基本穩定。

2.3.2 精密度試驗:將黃芪藥材樣品溶液連續進樣5次，考察精密度。結果表明，所有色譜峰的相對保留時間 RSD均≤1．5%，相對峰面積 RSD均≤1.8%，表明儀器的RSD良好。

2.3.3 重復性試驗:制備5份黃芪藥材樣品溶液并進行檢測，考察方法的重現性。結果表明，所有色譜峰的相對保留時間 RSD均 ＜1．5%，相對峰面積RSD均＜2．6%，表明方法的重現性良好。

2.4 指紋圖譜的建立 按照“2．2”項下方法制備黃芪藥材樣品溶液，分別采用不同色譜柱依次進樣，記錄色譜圖，按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》建立HPLC-DAD指紋圖譜(圖1)。

圖1 10批次黃芪藥材高效液相色譜－二極管陣列檢測法3種色譜柱疊加色譜圖

由圖1可以看出，10批次黃芪藥材在3種色譜柱的圖譜輪廓比較接近，其相對保留時間和相對峰面積也基本一致，具有較高的相似性。但從C柱的色譜圖中可以發現其中部分色譜峰出現托尾的情況，其理論板數也低于A柱和B柱的相應色譜峰，存在較為明顯的差異。

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2．0版》自動匹配10批次黃芪藥材HPLC-DAD圖譜的相關參數，標定其中匹配數目為10的11個色譜峰為共有指紋峰，共有指紋峰面積均＞色譜峰總面積的90%。

2.5 相似度的計算及統計分析 采用夾角余弦法對3種色譜柱中黃芪藥材的HPLC-DAD指紋圖譜進行相似度計算，并采用SPSS 16．0統計軟件進行配對t檢驗，結果見表1、2。

表1 10批次黃芪藥材高效液相色譜－二級管陣列檢測法指紋圖譜相似度計算結果

表2 3種色譜柱獲取的高效液相色譜－二級管陣列檢測法指紋圖譜相似度配對t檢驗結果

由表2可以看出，A柱和B柱色譜間相似度差異無統計學意義(P＞0.05)。而C柱與A柱和B柱間的相似度差異有統計學意義(P＜0.05)。從平均值可以看出，A柱和B柱之間的相似度比較一致，且均高于C柱。結合特征色譜峰的峰形和相應的理論板數，可以初步確定A柱和B柱較C柱更適合黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜的評價研究。

3 討論

通過對黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜的研究，可以確定色譜柱對指紋圖譜獲取的穩定性與重現性具有極其重要的作用。由于生產工藝的不同，即使填料相同的色譜柱也可能使相似度評價產生較大的差異。因此，采用HPLC-DAD指紋圖譜技術進行中藥質量控制與評價，有必要在指紋圖譜研究中增加特征色譜峰的理論板數和分離度等系統適應性試驗要求，使用于指紋圖譜研究的色譜方法更加完整和嚴謹，保證方法的準確性和穩定性。

采用統計學分析的方法對不同色譜柱獲取的HPLC-DAD指紋圖譜相似度進行比較和評價，減少了主觀判斷可能出現的錯誤，這種方法的科學性還有待于進一步的探討和分析。

本實驗對黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜在不同色譜柱間的相似度差異進行了考察和評價，進一步保證指紋圖譜相似度計算結果的準確可靠，為黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜的廣泛應用提供依據，有利于相關研究的順利開展。

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