牛蒡子苷元對人食管癌細胞增殖和凋亡的影響及機制研究

杜建新，馬洪德

(1.平頂山市第二人民醫院感染性疾病科 河南平頂山 467000;2.平頂山市第一人民醫院 感染性疾病科 河南平頂山 467012)

牛蒡子在體外可抑制胰腺癌、肝癌、白血病等腫瘤細胞的生長［1-4］，牛蒡子苷元(ARG)是牛蒡子的主要活性成分。食管癌臨床常見，ARG對人食管癌的作用尚不明了，本研究發現了ARG對人食管癌細胞的作用，為食管癌的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 EC-1(鄭州大學病理實驗室提供)，ARG(上海融禾醫藥科技發展有限公司);RPMI1640培養液，胎牛血清;免疫組化試劑盒;細胞凋亡檢測試劑盒;酶標儀、水平電泳儀、流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將EC-1接種于37℃ RPMI1640培養液，置于5%CO2培養箱中培養。2～3 d傳代后，取生長對數期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率:取對數生長期EC-1細胞常規消化，用RPMI1640配成單細胞懸液，以每孔104～105個細胞接種于96孔培養板中，培養24 h，實驗組加用含不同濃度ARG的培養液，使其終濃度分別為2.5、5、10 mg/L;對照組加培養液。繼續培養48 h后，加入MIT溶液，繼續孵育4 h，加入DMSO，使結晶物充分溶解。選擇570 nm波長，測定各孔光吸收值，計算生長抑制率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期:取對數生長期細胞，常規制成單細胞懸液，以1.25×105/ml密度接種于培養瓶中，24 h后加入各濃度ARG培養24 h，收集細胞移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，用PBS溶液清洗1次，在離心管中留約0.5 ml PBS，加入70%冰乙醇5 ml混勻固定，4℃放置48 h以上。之后離心離去乙醇，PBS清洗1次，在離心管中留1 ml PBS，加入Rnase酶，室溫放置30 min。再用50 μg/ml的碘化丙啶(PI)染色后，用流式細胞儀分析細胞周期。

1.2.4 免疫組化檢測增殖細胞核抗原:將傳代的EC-1以2×105/ml接種12孔培養板，作細胞爬片。細胞生長至80%以上融合度時，加入含0.4%血清的培養液行同步化處理24 h，按上述分組加入不同濃度ARG后繼續培養24 h。將培養板孔中的蓋玻片取出，PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min，按SP試劑盒操作方法進行免疫組化PCNA檢測，DAB顯色，同時用PBS代替一抗作陰性對照。判定:IDA-2000數碼顯微圖像分析系統對免疫組化染色切片進行圖像分析，以平均吸光度半定量PCNA表達的強度。

1.2.5 流式細胞儀分析凋亡細胞百分率:取EC-1制成1×108/L單細胞懸液，細胞貼壁后分別加入10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的 ARG，對照組加入培養液，處理24 h后收集細胞;取5×104個重懸的細胞離心后，采用Annexin.VFITC/PI法染色。用流式細胞儀檢測，每組重復3次，取平均值。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳和DNA缺口末端標記法檢測細胞凋亡:將5×107/L細胞懸液接種于35 mm培養皿中，將用多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片置于培養皿內，37℃，5%CO2培養箱中培養，使細胞自然在蓋玻片上貼壁生長。24 h后分別加入10、20、40 mg/L的ARG，對照組加培養液，繼續培養48 h。吸棄培養皿內的培養液，37℃PBS輕洗3次，以4%多聚甲醛固定。按照原位凋亡細胞檢測試劑盒中說明書進行操作。計數凋亡細胞數目及總細胞數目，并計算細胞凋亡指數。

1.2.7 免疫組化檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達:按照試劑盒說明進行細胞爬片，方法同TUNEL。24 h后，將載玻片取出，PBS洗3次，置于多聚甲醛中固定30 min。PBS洗3次，將載玻片取出置于濕盒中滴加3%過氧化氫溶液，浸泡15 min，然后PBS洗3遍，每次3 min。滴加一抗:分別為1∶50的 Bcl-2和Bax，置濕盒中37℃溫浴120 min。棄一抗，PBS漂洗3遍。滴加二抗，置濕盒中室溫孵育1 h。PBS漂洗3遍，每次3 min。DAB顯色:將現配的DAB染色劑加于載玻片上，室溫顯色，至陽性棕色顆粒出現，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。用光鏡高倍鏡下(400倍)觀察，每組隨機取5張玻片，隨機選擇5個視野，計算100個細胞的陽性細胞數。

1.3 統計學方法 應用SPSS12.0計算機統計軟件進行數據處理，所有數據均用均數±標準差()表示，多組計量資料的比較用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準，P ＜0.05 有統計學差異。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制率 ARG在2.5～10 mg/L濃度范圍內對EC-1細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度逐漸增強，與對照組有統計學差異(P＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度的ARG對EC-1增殖的抑制率(%)的影響(n=4，)

表1 不同濃度的ARG對EC-1增殖的抑制率(%)的影響(n=4，)

與對照組相比，△P ＜0.05。

2.2 流式細胞儀檢測EC-1細胞周期 不同濃度ARG組G0/G1期細胞百分率較對照組顯著增加，S期細胞百分率顯著降低，見表2。

表2 不同濃度的ARG對EC-1細胞周期的影響(n=4，)

表2 不同濃度的ARG對EC-1細胞周期的影響(n=4，)

與對照組相比，*P＜0.05。

2.3 牛蒡子苷元對EC-1內PCNA表達的影響 免疫組化染色顯示，對照組胞核著色最深，呈棕黃色，實驗組隨著ARG用量的增加胞核著色逐漸減弱。圖像分析結果顯示:5 mg/L和10 mg/L ARG組平均吸光度較對照組明顯減低(P＜0.05)，見表3。

表3 牛蒡子苷元對EC-1內PCNA表達的影響(n=4，)

表3 牛蒡子苷元對EC-1內PCNA表達的影響(n=4，)

與對照組相比，#P ＜0.05。

2.4 流式細胞儀分析凋亡細胞百分率 10、20、40 mg/L ARG處理EC-1細胞后可見凋亡峰，其凋亡率分別為(2.251 ± 0.165)%、(3.557 ± 0.086)%、(8.087 ±0.064)%，對照組的凋亡率為(1.113 ±0.021)%。ARG處理細胞的凋亡率高于對照組，有統計學差異(P＜0.05)。見表4。

表4 流式細胞儀檢測不同濃度ARG處理后EC-1細胞凋亡百分率(n=3，)

表4 流式細胞儀檢測不同濃度ARG處理后EC-1細胞凋亡百分率(n=3，)

與對照組比較，◆P＜0.05;★P＜0.01。

2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 經10、20、40 mg/L ARG處理的EC-1細胞進行TUNEL法檢測有凋亡細胞出現，其凋亡指數分別為(30.16 ±1.57)%、(70.34 ±0.44)%、(80.43 ±1.31)%，對照組的凋亡指數為(6.27±0.13)%。對照組與任一藥物組間比較有統計學差異(P ＜0.05)，見表5。

表5 TUNEL檢測不同濃度ARG處理后EC-1 細胞凋亡指數(n=5，)

表5 TUNEL檢測不同濃度ARG處理后EC-1 細胞凋亡指數(n=5，)

與對照組比較，◆P＜0.05;★P＜0.01。

2.6 免疫組化檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達 經10、20、40 mg/L ARG處理的EC-1細胞Bax表達明顯升高，其陽性表達率分別為(54.54±1.53)%、(80.50 ±1.94)%、(85.42 ±0.74)%，對照組的陽性表達率為(16.14±1.73)%;Bcl-2表達明顯減低，其陽性表達率分別為(53.57 ±1.17)%、(13.56 ±1.19)%，對照組的陽性表達率為(84.94±0.85)%，對照組與任一藥物組間比較有統計學差異(P＜0.05)，見表6。

表6 ARG對EC-1細胞Bax、Bcl-2表達率的影響(n=5，)

表6 ARG對EC-1細胞Bax、Bcl-2表達率的影響(n=5，)

與對照組比較，◆P＜0.05;★P＜0.01。

3 討論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，由于其起病隱匿，確診時大多為中晚期，患者多無手術及放療的適應癥，化療亦多無明顯效果，研制新型抗癌藥物實屬必要。中藥的細胞毒作用大多小于化療藥物，近年來從天然植物內尋找敏感，且毒副反應小的抗癌活性成分已成為國內外研究的熱點。牛蒡子具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、抗菌等作用。ARG為牛蒡子的主要活性成分，對小鼠皮膚癌、大鼠肺癌、肝癌有顯著的抑制活性，而對人食管癌細胞的影響報道極少。腫瘤的特征是無限增殖，抑制腫瘤細胞增殖已成抗腫瘤治療研究的熱點，PCNA又稱細胞周期蛋白，與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，主要在增殖細胞中合成和表達，是反映細胞增殖狀態的良好指標，并可作為細胞增殖的標記［5］，在細胞周期調控方面發揮著重要作用［6］。國內外在許多腫瘤中進行了PCNA的研究，涉及PCNA與腫瘤發生發展等方面，抑制PCNA的表達可抑制癌細胞的克隆形成能力。本文MTT證實ARG在2.5～10 mg/L濃度范圍內可抑制EC-1細胞的增殖，且有劑量依賴性。不同濃度ARG組平均吸光度較對照組均減低，推測ARG具有抑制EC-1細胞增殖的作用。

正常細胞增殖的調控大致分為正調節和負調節。腫瘤是生物體細胞正常生長失去控制的結果，正調節使細胞進入增殖周期，阻止細胞分化，負調節則抑制細胞進入細胞增殖周期。若正負調節失控，則導致腫瘤形成。細胞周期各時相的變化依賴細胞周期蛋白的調控，ARG抑制EC-1細胞增殖的分子機制仍有待于進一步研究。

細胞凋亡是細胞衰老、死亡的一種主動過程，按著一定的程序進行，又稱細胞程序性死亡，其過程包括3個階段:染色質壓縮從而呈致密堿性染色，核離散和細胞體積縮小，細胞密度增大。凋亡是能量依賴的細胞內死亡程序活化的細胞自殺，由基因控制，它是維持機體正常生理功能和自身穩定的重要機理，是生命過程中不可缺少的內容。現已經認識到許多疾病與細胞凋亡規律失常有關。腫瘤不僅是增殖異常的疾病，而且也是凋亡異常的疾病，目前認為細胞凋亡受抑，打破了正常組織中細胞增殖與凋亡的平衡調節。有研究表明腫瘤促進劑TPA可通過抑制細胞凋亡，促進腫瘤的形成，B細胞淋巴瘤染色體移位激活了Bcl-2基因，抑制細胞凋亡而引發腫瘤。臨床上腫瘤放療化療的機理之一，即是引發腫瘤細胞凋亡，同時細胞凋亡的檢測可作為篩選有效抗癌藥物的簡便方法，有針對性誘導腫瘤細胞凋亡，從而使正常細胞免受化療、放療之害是今后腫瘤治療的方向。本文的實驗表明在加入ARG后的細胞中出現細胞凋亡明顯增多;DNA缺口末端標記法檢測顯示ARG組凋亡細胞數明顯增加，根據以上實驗發現ARG具有明顯誘導EC-1細胞凋亡的作用。

細胞凋亡是由凋亡基因控制的，研究提示［7］細胞內與凋亡相關的基因可分為兩大類，即存活基因和致死基因。線粒體膜上Bcl-2和Bax是最重要的一類細胞凋亡調控基因［8］。Bcl-2基因不同于其他的抑癌基因，可加速細胞分裂、細胞增殖，維持細胞生存，延長細胞壽命，導致細胞數增加。Bcl-2具有抗凋亡的作用，Bax具有促細胞凋亡的作用。Bcl-2與腫瘤的發生密切相關，Bcl-2可抑制多種因素引起的細胞凋亡，其抑制細胞凋亡的機制有以下幾種可能:①作為一種抗氧化劑，調節細胞的氧化還原狀態;②與Bax結合成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用;③影響細胞鈣離子的重新分布、鈣離子激活內源性的內切酶和谷氨酰胺轉移酶;④抑制細胞色素C從線粒體釋放到胞漿，細胞色素C是促進凋亡的。Bcl-2抑制細胞凋亡必須與Bax形成異源二聚體來實現。本文研究顯示ARG組EC-1細胞內Bcl-2蛋白減少，而Bax蛋白較對照組明顯增高，表明ARG促進了EC-1細胞凋亡。其機理與Bax/Bax比例大于Bcl-2/Bax有關，從而導致細胞發生凋亡，抑制了腫瘤細胞的生長。因此，深入研究ARG對食道癌細胞增殖與凋亡的作用，將為ARG作為潛在的抗腫瘤藥物提供實驗依據。

［1］鄭國燦.牛蒡子苷對胰腺癌細胞抑制作用及其作用機理的實驗研究［J］.時珍國醫國藥，2008，19(10):2384-2386.

［2］鄭國燦，王兵，錢程佳，等.牛蒡子苷元對肝癌SMMC-7721細胞增殖、凋亡的影響及機制探討［J］.山東醫學，2011，51(14):13-15.

［3］Yao X，Zhu F，Zhao Z，et al.Arctigenin enhances chemosensitivity of cancer cells to cisplatin through inhibition of the STAT3 signaling pathway［J］.J Cell Biochem，2011，112(10):2837-2849.

［4］Guirong C，Liping C，Deqiang D，et al.Synthesis of(-)-arctigenin derivatives and their anticancer activity［J］.Net Prod Res，2011，26(12)，177-181.

［5］Paunesku T，Mittal S，Protic M，et al.Proliferating cell nuclear antigen:ringmaster of the genome［J］.Int J Radiat Biol，2001，77(10):1007-1021.

［6］QemeneIIr L，Gerland L M，Flacher M，et al.Differential control of cell cycle，proliferation，and survival of primary T lymphocytes by purine and pyrimidine nucleotides［J］.J Immuol，2003，170(10):4986-4995.

［7］Petit P X，Zanmami N，Vayssiere J L，et al.Implication of mitochondria in apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，1997，174(1-2):185-188.

［8］Cory S，Huang D C，Adams J M.The Bcl-2 family:roles in cell survival and oncogenesis［J］.Oncogene，2003，22(53):590-607.