以KDR為啟動子的雙自殺基因系統誘導結腸癌細胞凋亡的實驗研究

王朝陽，黃宗海

（1．內蒙古醫科大學附屬醫院 普外科，內蒙古 呼和浩特010051；2．南方醫科大學珠江醫院 普外科，廣東 廣州510282）

將自殺基因與化療藥物聯合是目前主要的基因治療策略，多種自殺基因已經進入臨床試驗階段，是非常有前景的基因治療手段［1］。但研究發現，單自殺基因系統治療效果不理想并缺乏對腫瘤細胞殺傷的靶向性。因此本實驗設計應用2種自殺基因聯合治療以提高腫瘤的殺傷效果，利用血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進血管內皮細胞增殖、分化，血管內皮生長因子受體（KDR）在腫瘤血管內皮細胞中高表達的特點，以腫瘤血管為治療靶點，可以降低對正常細胞的毒性。我們前期研究已經構建重組腺病毒pAdEsay－KDR－CDglyTK載體［2］，本研究以KDR作為啟動子驅動雙自殺基因治療，觀察其對高表達KDR的結腸癌HCT116細胞和低表達KDR的LS174T細胞的殺傷作用，為進一步研究此雙自殺基因治療體系的療效提供實驗支持。

1 材料和方法

1．1 材料

重組腺病毒pAdEsay－KDR－CDglyTK（珠江醫院普外科構建）；HCT116、LS174（中山大學細胞庫）；293細胞（ATCC）；胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI1640（Gibco）；Trizol Reagent（invitrogen）；2×Taq PCR MasterMix（北京天根生物技術公司）；RT－PCR試劑盒（Fermentas）；5－FC、GCV、四甲唑藍（MTT）（Sigma）；CD－TK引物（上海英俊生物有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 重組腺病毒轉染HCT116、LS174T細胞用含10%胎牛血清的1640培養液培養HCT116和LS174T細胞，以2×105個／孔接種于6孔板，待細胞融合度達70%－80%，以不同感染復數（MOI）的腺病毒轉染后緩慢震蕩2－3h，補足培養液在37℃、5%CO2細胞培養箱內培養72h，熒光顯微鏡下計數綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞百分比。

1．2．2 RT－PCR檢測目的基因 CDglyTK 表達收集轉染及未轉染的HCT116和LS174T細胞，TRIzol提取細胞的總RNA，分光光度計檢測A260，按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。CD－TK引 物 序 列 上 游 P1：5′－AGGCTAACAGTGTCGAATAACGCT－3′，下 游 P2：5′－GTTAGCCTCCCCCATCTC－3′。反 應 條件：94℃ 預 變 性 5 min，1個循環；94℃變性40sec，57℃退火1min，72℃延伸1．5min，30個循環后72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照。

1．2．3 化療藥GCV及5－FC對轉染細胞的細胞毒作用 將HCT116和LS174T細胞制成濃度為1×105／ml的單細胞懸液接種于96孔培養板中，48h后融合度約為80%，用100MOI的重組腺病毒轉染；培養24h后分別加入梯度濃度的前藥，GCV為0．01mg／L，0．1mg／L，1mg／L，10mg／L，100mg／L，1 000mg／L，5－FC為20mg／L，40mg／L，80mg／L，160mg／L，320mg／L，640mg／L。培養72h后，加入5g／L MTT 20μl，孵育4h；吸去上清，加入200ml／孔DMSO，振搖10min，酶標儀檢測每孔在490nm波長下的吸光度值（A），以不含細胞的培養基作空白對照，實驗重復3次，設3個平行孔。計算細胞相對存活率＝試驗組OD值／對照組OD值×100%。

1．2．4 流式細胞儀（FCM）分析細胞周期及凋亡情況 將HCT116接種于6孔板中，48h后用100MOI的重組腺病毒感染，培養24h，加入1mg／L GCV和80mg／L 5－FC，設置陰性對照組，繼續培養48h后收集細胞，PBS洗2次，1 000r／min離心5min，去上清液，－20℃預冷的70%乙醇固定1h。用200μl PBS制備細胞懸液加入等體積碘化丙碇染液混合，4℃放置30min上機。ModfitLT20軟件分析細胞周期和細胞凋亡的變化情況。

1．2．5 免疫組織化學法檢測Caspase3的表達HCT116細胞接種及轉染方法同上。將感染和未感染CD／TK基因的HCT116細胞涂片，多聚甲醛固定，3%H2O2室溫封閉5－10min，正常山羊血清封閉室溫20min，甩去多余液體。滴加兔抗人Caspase3抗體（1∶100），37℃2h，生物素抗兔IgG 37℃30min，SABC 20min，DAB顯色。各步驟之間用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3遍，梯度酒精脫水后，封片，拍照。陽性標準：細胞漿發現棕黃色顆粒為陽性細胞。在光學顯微鏡下觀察，隨機選擇5個不同視野，每次細胞記數不少于200個，計算細胞陽性率。

1．2．6 統計方法 用SPSS13．0統計軟件進行分析，計量資料采取獨立樣本t檢驗，結果用ˉx±s表示；計數資料兩組間比較采用 Mann－Whitney U秩和檢驗分析，P＜0．05表示有統計學意義。

2 結果

2．1 重組腺病毒對結腸癌細胞的轉染情況

不同MOI的重組腺病毒轉染HCT116和LS174T細胞72h，結果顯示轉染率與腺病毒感染復數呈正相關，MOI＝10時，僅顯示少數微弱的熒光；MOI＝100時，90%以上的細胞表達熒光；MOI＝200時，95%以上的細胞表達較強的綠色熒光，腺病毒對兩種腫瘤細胞的轉染效率相似（圖1）。

2．2 Ad－KDR－CDglyTK基因表達產物的鑒定

RT－PCR結果顯示：轉染后的HCT116內能檢測到目的基因Ad－KDR－CDglyTK的表達，電泳圖上可見約2 400bp陽性條帶，LS174T細胞內則未檢測到目的融和基因的表達（圖2）。

2．3 重組腺病毒AdKDR－CDglyTK轉染后結腸癌細胞存活率的測定

圖1 重組腺病毒對HCT116和LS174T細胞的轉染情況

圖2 RT－PCR鑒定CDglyTK mRNA的表達

MTT檢測結果顯示：腺病毒 AdKDR－CDglyTK轉染HCT116細胞后對前藥GCV和5－FC的敏感性較高，細胞殺傷作用呈劑量依賴性，隨前藥濃度增加，生長抑制作用逐漸增強，細胞存活率明顯下降，差異有統計學意義（P＜0．001）。但相同劑量的前藥對轉染腺病毒AdKDR－CDglyTK的LS174T細胞不敏感，轉染后的LS174T細胞的存活率不隨前藥濃度的改變而變化（圖3）。

圖3 AdKDR－CDglyTK對HCT116、LS174T細胞存活率的影響

2．4 以為KDR啟動子的雙自殺基因系統CDglyTK促進細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示：前藥GCV 1mg／L、5－FC 80mg／L 作用 HCT116細胞48h，HCT116細胞G0／G1升高而S期下降（P＜0．01）。治療組GO－G1期峰左側出現凋亡峰，凋亡率為14．83%，而陰性對照組未出現明顯的凋亡峰，差異均有統計學意義（P＜0．01）（表1，圖4）。

表1 以為KDR啟動子的雙自殺基因系統CDglyTK對HCT116細胞的周期分布及凋亡的影響（%）

2．5 caspase3蛋白在HCT116細胞中的表達

Caspase3免疫反應陽性產物呈棕黃色，主要在胞漿表達，少量胞核有微量表達。前藥GCV 1mg／L、5－FC 80mg／L作用 HCT116細胞48h，治療組caspase3蛋白表達明顯高于陰性對照組的蛋白表達，治療組陽性細胞占55．86%，陰性對照組陽性細胞占25．94%，差異具有統計學意義P＜0．01（圖5）。

3 討論

腫瘤的自殺基因治療策略是將某些細菌或病毒中對藥物敏感的基因用基因工程技術構建到載體上導入腫瘤細胞中，此基因編碼的特異性酶能將對細胞無毒或毒性低的藥物前體代謝為細胞毒性藥物，以提高腫瘤細胞對藥物的敏感性［3］。由于腫瘤的發生、發展的復雜性，單自殺基因治療具有表達不穩定、轉染效率不足、特異靶向性不強、對腫瘤細胞殺傷效果低等缺點，應用單前藥體系很難達到根治腫瘤、抑制腫瘤轉移的目的，多個自殺基因的聯合是提高療效的主要途徑之一。

圖4 HCT116細胞的DNA含量和細胞周期

圖5 免疫細胞化學檢測HCT116細胞caspase3蛋白表達（A圖為對照組，B圖為治療組）

CD／5－FC和TK／GCV是目前研究最為深入的兩種自殺基因系統。單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（herps simplex virus typeⅠ thymidine kinase，HSV－Ⅰ TK）催化更昔洛韋（Ganciclovir，GCV）磷酸化，經細胞激酶轉化成三磷酸GCV，滲入到分裂細胞的DNA中，抑制DNA合成［4］。胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）將無毒的5－FC轉化為高度細胞毒性的5－FU，抑制胸苷酸合成酶活性影響DNA復制，并以偽代謝物形式滲入到RNA中，干擾RNA功能抑制蛋白質合成［5，6］。二者作用機制相似，但作用環節不同，聯合轉染將會產生相加或協同效應殺傷敏感性不同的腫瘤細胞。本研究通過流式細胞儀檢測證實，給予前藥5－FC和GCV后轉基因HCT116細胞被阻滯于G0－G1期，S期下降，出現明顯的凋亡峰，提示結腸癌細胞的DNA合成被抑制，雙自殺基因系統能特異性抑制結腸癌HCT116細胞增殖。

基因治療的關鍵是將目的基因片段高效地導入靶細胞并獲得有效穩定的表達。治療的靶向性是優化基因治療策略的重要環節，利用腫瘤組織特異性啟動子驅動自殺基因在腫瘤細胞中表達是實現腫瘤治療的靶向性、提高轉染效率的有效手段。血管內皮生長因子（VEGF）能增強小血管內皮細胞內的代謝、引起血管外基質成分改變刺激內皮細胞增殖和遷移，在血管新生中起重要作用。實驗證實VEGF的表達水平能反映腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移和血管構建水平，直接反映腫瘤生長速度和轉移傾向［7］。在實體腫瘤原發灶及遠處轉移灶中可檢測到的VEGF及其受體（KDR）表達水平明顯升高，而在正常血管表達弱或不表達［8］。因此。本研究構建以KDR為啟動子驅動雙自殺基因系統，將有高度腫瘤特異性KDR與雙自殺基因系統結合起來，提高自殺基因系統對腫瘤組織及腫瘤血管的靶向性而對正常組織影響較小。實驗結果表明轉染Ad－KDR－CDglyTK后，表 達 KDR 的 結 腸 癌 細 胞HCT116的生存率隨前藥5－FC和GCV濃度的增加而遞減，而不表達KDR的LS174T細胞生存率則幾乎不受影響。證實以KDR為啟動子調控雙自殺基因系統能增強腫瘤組織的靶向特異性、提高轉染效率。

Caspase家族被認為是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，Caspase－3廣泛存在于正常人體組織及多種腫瘤組織中，正常情況下，胞質內的caspase－3以無活性的酶原形式存在，只有當細胞凋亡時才被激活為有活性的caspase－3，在細胞凋亡的執行階段，caspase－3水解底物蛋白，引起細胞凋亡［9］。本實驗通過免疫組織化學的方法檢測腫瘤細胞內caspase－3蛋白含量，結果顯示治療組的caspase－3蛋白表達明顯高于對照組，說明前藥作用于轉基因HCT116細胞后誘導細胞凋亡，其機制可能是通過誘導細胞內caspase－3活性升高，增強caspase－3促進細胞凋亡途徑實現的。

綜上所述，以KDR基因為啟動子可以提高對腫瘤細胞和腫瘤血管組織的靶向性，雙自殺基因系統可增強轉染效率、提高對腫瘤細胞的殺傷效果、誘導腫瘤細胞凋亡。

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