殼聚糖納米粒子基因載體的制備與相關(guān)研究

李世龍，邵國喜，劉欽毅＊，周 賀

（1．長(zhǎng)春師范學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130032；2．吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；3．65316部隊(duì)醫(yī)院）

隨著對(duì)脊髓損傷發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展和人類基因組計(jì)劃的劃時(shí)代完成，脊髓損傷的醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入基因治療的時(shí)代。許多研究表明，GDNF對(duì)脊髓神經(jīng)元具有很強(qiáng)的營養(yǎng)活性，并能促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，如果能夠使GDNF基因在損傷的脊髓中高效表達(dá)，則能有效地減輕脊髓繼發(fā)性損傷，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。

在納米顆粒的表面通過靜電作用，吸附DNA，或通過化學(xué)鍵耦聯(lián)DNA，可作為基因的載體，為基因治療中的DNA傳遞帶來了新的希望。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料LB培養(yǎng)基，RNase，殼聚糖，脫乙酰度90%等，實(shí)驗(yàn)所用PcDNA3．1／GDNF已經(jīng)合成［1］。實(shí)驗(yàn)儀器有電磁力攪拌器，Zetasizer HS3000檢測(cè)儀，QL－901旋渦混合器，F(xiàn)innpipette轉(zhuǎn)移器，紫外分光光度儀，電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)等。

1．2 質(zhì)粒殼聚糖納米粒子的制備

首先用復(fù)凝聚法制備殼聚糖納米粒子，稱取殼聚糖500mg，將之溶解于1%乙酸溶液中，濃度為0．5%（pH 為5．5），充分?jǐn)嚢?，至澄清為止，?jīng)0．22 μm的微孔濾膜過濾除菌。將質(zhì)粒基因進(jìn)行大量擴(kuò)增。將100μl質(zhì)?；蛉芤海?20μg／ml）和10 mMNa2SO4100μl混合于一EP管中，殼聚糖溶液200μl放于另一EP管中，55℃水浴中加熱20min，將質(zhì)粒混合溶液快速移入殼聚糖溶液中，在旋渦混合器上震蕩1小時(shí) 。以12 000r／min，離心30分鐘，沉淀以 PBS（pH 為5．5）重懸，即為 CS／pcDNA3．1／GDNF混懸液。

1．3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

1．3．1 殼聚糖納米粒子的物理性能檢測(cè)

（1）取少量納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置5min，用濾紙吸干混懸液的液滴，于電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。

（2）取少量納米粒混懸液應(yīng)用微粒度儀檢測(cè)其粒徑大小。

（3）將納米粒混懸液的pH分別調(diào)整為3、5、7、9時(shí)，應(yīng)用Zetasizer HS3000檢測(cè)儀檢測(cè)納米粒子表面的電位。

（4）取殼聚糖納米粒子質(zhì)?；驈?fù)合體樣品適量，放入帶瓶塞的錐形瓶中，分別于25℃和37℃條件下放置，10d后觀察其物理外觀、測(cè)定其平均粒徑，考察殼聚糖納米粒子質(zhì)?；驈?fù)合體的穩(wěn)定性。

1．3．2 殼聚糖納米粒子與質(zhì)?；蚪Y(jié)合效率的檢測(cè)

（1）分別取3份50μl殼聚糖納米粒子分別調(diào)至pH為3、5、7、9和3份50μl的質(zhì)?；蛉芤杭尤氩煌腅ppendorf管中，于55℃溫浴20分鐘。

（2）將50μl納米粒與相同體積的質(zhì)粒均勻漩渦振蕩1分鐘。

（3）1% 瓊脂糖凝膠 60V 電泳30min，pcDNA3．1／GDNF經(jīng)溴乙腚染色顯示。

（4）紫外透射儀觀察并凝膠照相。

1．3．3 殼聚糖納米粒子對(duì)質(zhì)?；虮Ｗo(hù)效果的檢測(cè)

為了檢測(cè)殼聚糖納米粒子對(duì)質(zhì)?；虮Ｗo(hù)效果，在制備納米粒子后將納米粒子與質(zhì)粒基因結(jié)合，然后用DNase I消化，再通過凝膠電泳觀察保護(hù)效果。取100μl殼聚糖納米粒子與100μl的質(zhì)?；蛉芤侯A(yù)熱后混合（同上），后加入Eppendorf管中，并向管中加入1．0μl DNase I，37℃水浴1小時(shí)后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外透射儀觀察并凝膠照相。

1．3．4 殼聚糖納米粒子質(zhì)?；驈?fù)合體體外釋放質(zhì)?；虻膶?shí)驗(yàn)

將制備殼聚糖納米粒子質(zhì)粒基因微粒沉淀（20 mg）以1ml PBS（pH7．4）重懸，于37℃水浴恒溫振蕩器中輕搖，每一小時(shí)離心，取10μl上清液后，再次重懸。UV法在波長(zhǎng)260nm處測(cè)定上清液中質(zhì)?；虻臐舛龋谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線，觀察殼聚糖納米粒子質(zhì)?；驈?fù)合體體外釋放質(zhì)?；虻奶攸c(diǎn)。

1．3．5 載基因納米粒的載藥量和包封率的測(cè)定

在納米粒制備過程中包封率和載藥量是兩個(gè)比較重要的指標(biāo)。載藥量能夠反映殼聚糖加載基因的能力；包封率可以反映納米粒制備方法的優(yōu)劣。在測(cè)定包封率和載藥量時(shí)，我們采取的策略是首先測(cè)試出在納米粒制備過程中未被包封的GDNF質(zhì)粒和未成粒子的殼聚糖的含量，然后再根據(jù)制備納米粒時(shí)GDNF質(zhì)粒和殼聚糖的投料量分別計(jì)算出包封率和載藥量。

1．4 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料采用ˉx±s，用SPSS12．0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 殼聚糖納米粒子的物理性能

2．1．1 掃描電鏡的檢測(cè)結(jié)果顯示殼聚糖納米粒子為白色，圓形或略呈橢圓形，在混懸液中分布均勻，經(jīng)高速離心濃縮后單位視野分布較均勻。殼聚糖納米粒徑大小分布成正態(tài)分布，平均粒徑大小為106 nm，最大粒徑為228nm，最小粒徑為52nm。

2．1．2 當(dāng)納米粒子混懸液的pH分別調(diào)整為3、5、7、9時(shí)，殼聚糖納米粒子的Zeta電位發(fā)生了變化，當(dāng)混懸液處于pH＝3的酸性環(huán)境下，其Zeta電位為＋16．3±0．4mv，說明納米表面帶有較多正電荷，當(dāng)混懸液pH＝5的環(huán)境下，Zeta電位為＋3．5±0．2，說明納米粒表面仍然帶有部分正電荷，當(dāng)混懸液pH＝7或pH＝9時(shí)，納米粒表面Zeta電位分別為－11．5±0．3與－19．1±0．5，說明納米粒子表面帶有負(fù)電荷?？梢?，pH對(duì)殼聚糖納米粒的Zeta電位的影響較大。

2．1．3 殼聚糖納米粒子質(zhì)?；驈?fù)合體穩(wěn)定性觀察，見表1。納米粒在4℃、20℃、37℃時(shí)放置5d、10 d。觀察其形狀無明顯變化，均為圓形、平均粒徑在4℃時(shí)無明顯變化，在20℃、37℃時(shí)粒徑略縮小，說明其性質(zhì)較穩(wěn)定，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的需要。

表1 殼聚糖納米粒子質(zhì)粒基因復(fù)合體穩(wěn)定性觀察

2．2 結(jié)合效率檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，殼聚糖納米粒子能有效結(jié)合質(zhì)粒，紫外透射儀觀察和凝膠照相顯示的是在不同酸堿度條件下殼聚糖納米粒和質(zhì)粒的結(jié)合情況。在酸性條件下（pH＝3與pH＝5時(shí)），質(zhì)粒結(jié)合能力較強(qiáng)，電泳中顯示泳動(dòng)速度慢，幾乎未出孔，pH＝7，pH＝9時(shí)，殼聚糖納米粒和質(zhì)粒結(jié)合能力弱，電泳顯示泳動(dòng)速度較快。

2．3 基因保護(hù)試驗(yàn)

與殼聚糖納米粒結(jié)合的pcDNA3．1／GDNF質(zhì)粒加入0．5UDnase I，37℃水浴1h后紫外透射儀觀察和凝膠照相均顯示明顯的DNA條帶，而未與殼聚糖納米粒結(jié)合的pcDNA3．1／GDNF質(zhì)粒則無明顯的DNA條帶，結(jié)果顯示殼聚糖納米粒子有良好的DNA保護(hù)作用，使不被DNase I降解。

2．4 殼聚糖納米粒子基因釋放實(shí)驗(yàn)

納米粒的質(zhì)粒釋放曲線如圖1，可以看出納米粒中質(zhì)粒釋放明顯呈兩相釋放模式。第一階段在釋放初期，質(zhì)粒出現(xiàn)迅速釋放，在20h內(nèi)釋放了將近60%，這是微球表面和淺層結(jié)構(gòu)內(nèi)釋放出來。之后的第二階段，質(zhì)粒是隨著殼聚糖在緩沖溶液中的溶解而釋放，釋放速度趨于平緩，到48h時(shí)僅釋放了不到20%，然后質(zhì)粒繼續(xù)緩慢釋放。

圖1 納米粒子釋放質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)

2．5 載藥量和包封率的測(cè)定結(jié)果

見表2和表3，從測(cè)定結(jié)果看，納米粒的載藥量和包封率都比較理想。

表2 包封率的測(cè)定結(jié)果

表3 載藥量的測(cè)定結(jié)果

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，脊髓損傷治療取得了很大的進(jìn)展，其中細(xì)胞移植和基因治療給脊髓損傷帶來了新的希望，它們可以改善損傷局部的微環(huán)境，可以保護(hù)脊髓神經(jīng)元，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軸突的再生，最大限度的促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)。

在基因治療中，營養(yǎng)與保護(hù)的基因主要包括神經(jīng)營養(yǎng)因子基因族，包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等。受體細(xì)胞有雪旺氏細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、神經(jīng)分泌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，其中雪旺氏細(xì)胞應(yīng)用很廣。Lee［1］等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Bcl－X（L）基因轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞中觀察Bcl－X（L）過度表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的凋亡的影響，結(jié)果表明在2－7周細(xì)胞期間內(nèi)細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)Bcl－X（L），并在這個(gè)時(shí)間間期內(nèi)完全阻止了細(xì)胞凋亡。Tuszynski等［2］將NGF基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞后，移植到SCI部位，發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞在體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)NGF，并促軸索再生。Barakat等［3］將攜帶GDNF的重組腺病毒轉(zhuǎn)入脊髓橫斷損傷的新生鼠后肢骨骼肌中，結(jié)果在腰段脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)攜帶膠質(zhì)源性的神經(jīng)元營養(yǎng)因子表達(dá)，并保護(hù)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免于軸突斷裂誘發(fā)的細(xì)胞死亡；不管在體外和體內(nèi)的測(cè)試，GDNF都能提高胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活及分化，減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡，具有明顯的營養(yǎng)作用［4］。

研究表明，利用納米技術(shù)，如利用金納米微粒結(jié)合雜交DNA片段，很容易進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞核并與核內(nèi)染色體組合，具有較高的特異性［5］，殼聚糖是一種具有生物相容性和可生物降解的新型醫(yī)用生物材料，具有無刺激、無致敏、無抗原性、無致突變等優(yōu)點(diǎn)，殼聚糖及其衍生物能與DNA形成聚電解質(zhì)聚合物，是具有持久安全性和高效的陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)移運(yùn)輸載體，其應(yīng)用前景較好［6］。在溶液中CS分子帶有大量正電荷，能與質(zhì)粒DNA形成50－200 nm粒徑復(fù)合物，使DNA分子免受破壞。與聚乙二醇（PEG）等非生物降解的材料相比，此復(fù)合物是非常有效的體外或體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用復(fù)凝聚法制備CS／pcDNA3．1／GDNF，在電鏡下觀察 CS／pcDNA3．1／GDNF的形狀、大小、表面Zeta電位，并檢測(cè)CS－nano／pcDNA3．1／GDNF的穩(wěn)定性，觀察殼聚糖納米粒子與pcDNA3．1／GDNF的結(jié)合效率和對(duì)pcDNA3．1／GDNF的保護(hù)能力，殼聚糖納米粒子的緩釋試驗(yàn)，并檢測(cè)殼聚糖納米粒子的基因負(fù)載力和負(fù)載率。結(jié)果表明，應(yīng)用復(fù)凝聚法成功制備殼聚糖納米粒子，粒子大小符合基因轉(zhuǎn)染的需要，粒子性能穩(wěn)定；殼聚糖納米粒子與基因結(jié)合效率較高，對(duì)基因有很好的保護(hù)作用；殼聚糖納米粒子具有緩釋效果，其基因負(fù)載力和負(fù)載效率均較高。因此，殼聚糖納米粒子可以作為基因載體進(jìn)行脊髓損傷基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。

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