IL－6抗原抗體干預對T2DM大鼠肝臟IL－6mRNA表達的影響

陳 雨，鄭少雄，孟春梅，郝 杰

（天津醫科大學第二醫院 內分泌科，天津300211）

T2DM的病因可歸結為胰島β細胞分泌胰島素缺陷和胰島素作用障礙。炎癥或免疫因素是胰島素抵抗和β細胞功能衰竭的重要原因，大量的免疫炎癥介質參與了上述過程，其中，關于IL－6的作用一直是一個引起爭議的話題。本研究旨在探討炎癥因子IL－6在T2DM發病機制中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 健康雄性SD大鼠36只，平均體重254±7．5g，購于北京大學醫學部實驗動物中心。

1．1．2 主要試劑 高糖高脂乳劑（脂肪乳）；鏈脲佐菌素 （STZ）；IL－6 抗 原、抗 體；Trizol試 劑、Oligo（dT）18、dNTP、目的基因引物 DNA、內參基因引物DNA、逆轉錄酶。

1．2 方法

1．2．1 T2DM 大鼠模型的建立，IL－6抗原、抗體的干預及標本留取 按體重隨機分為4組：N組（正常對照組，10只），A 組（糖尿病IL－6抗原組，10只），B組（糖尿病IL－6抗體組，8只），C（糖尿病對照組，8只）。均普通飼料喂養。A、B、C三組連續7周按1ml／100mg體重／d給予脂肪乳灌胃，N組按同樣劑量給予水灌胃對照，之后稱取動物體重，按30mg／kg體重尾靜脈注射STZ。3天后，血糖測定結果大于16．7mmol／L為T2DM造模成功。造模后繼續普通飼料喂養和脂肪乳灌胃（0．5ml／100mg體重／d）。成模后第2天，A組給予IL－6抗原稀釋液（10 μg／ml）腹腔注射0．6ml／只／d，連續干預5天；B組給予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，連續干預4天，第5天IL－6抗體液（1mg／ml）腹腔注射0．6ml／只；C、N組均給予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，連續干預5天。四組大鼠均于成模后第7天處死。采集標本：剪尾測血糖，股動脈取血，稱重，并取肝臟液氮保存。

1．2．2 血糖及胰島素測定 羅氏血糖儀每周檢測血糖1次；血清胰島素采用液相平衡競爭放射免疫分析法測定。

1．2．3 按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清IL－6；提取大鼠肝細胞膜，按照試劑盒說明，采用固相夾心ELISA法測定肝組織細胞膜上胰島素受體（InsR）。

1．2．4 肝臟組IL－6mRNA表達 Trizol提取肝臟細胞總RNA，后經逆轉錄反應，合成cDNA，對其進行PCR擴增。采用的引物序列及反應參數如下：IL－6，上游：5’－AACTCCATCTGCCCTTCA－3’，下游引物：5’－GGTCCTTAGCCACTCCTT－3’。反應參數為94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個循環，72℃終末延伸10min，擴增片段長度588bp；內 參 基 因 β－actin，上 游：5’－CACCCGCGAGTACAACCTTC－3’，下游：5’－CCCATACCCACCATCACACC－3’，反 應 參 數 為 94℃ 5 min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環，72℃終末延伸10min，擴增片段長度232bp。用SYNGENE全自動凝膠成像分析系統對IL－6和內參β－actin的RT－PCR產物各條帶灰度進行圖像采集，計算IL－6／β－actin的比值，進行半定量分析。

1．3 統計學處理 應用SPSS11．5軟件包處理行統計分析，數據用ˉx±s表示，組間比較采用方差分析；采用Pearson相關系數評價IL－6抗原、抗體與血糖、胰島素等指標的相關性。

2 結果

2．1 一般情況 普通飲食飼養并輔以脂肪乳灌胃，7周后與對照組相比，糖尿病A、B、C組血清胰島素升高明顯（20．10±10．02，20．45±7．94，19．46±5．94vs11．57±5．85）（P＜0．05），7周時，各組大鼠體重的比較均無統計學差異。實驗結束時，糖尿病A、B、C組體重較對照組降低明顯（309．90±20．75，303．75±39．26，319．75±20．53vs410．60±22．37）（P＜0．05）；糖尿病A、B、C組血糖較對照組仍升高明顯（24．03±6．93，23．80±1．67，21．93±1．56 vs5．50±0．42）（P＜0．05）。

2．2 肝細胞膜InsR、血清IL－6的變化 與N組比較，A、B、C組大鼠肝細胞膜胰島素受體水平升高（7．09±4．93，7．03±4．97，6．84±4．65vs4．39±3．09）（P＜0．05）；與B、C、N組比較，A組大鼠血清IL－6水平明顯升高（1058．89±223．97vs404．34±60．33，411．72±126．17，407．43±88．52）（P＜0．05）。

2．3 IL－6抗原抗體干預前后對胰島素相關指標的影響

2．3．1 IL－6抗原及IL－6抗體等干預前后各組的血糖結果比較 見表1。A、B、C三組干預后較干預前血糖下降明顯（P＜0．05），但對各組內干預前后血糖的相關性分析顯示，二者無相關關系（P＞0．05）。表明IL－6抗原、IL－6抗體、PBS的干預對糖尿病大鼠的血糖沒有影響。

表1 干預前后各組組內的血糖變化

2．3．2 IL－6抗原及IL－6抗體等干預前后各組的胰島素結果比較 見表2。B、C二組干預后較干預前胰島素下降明顯（P＜0．05）；而與干預前相比，A組干預后的胰島素水平下降，無統計學意義（P＞0．05）。對各組內干預前后胰島素的相關性分析顯示，僅B組經IL－6抗體干預，前、后胰島素水平有相關性，相關系數r＝0．759（P＜0．05）。表明，IL－6抗體的干預能夠使糖尿病大鼠的胰島素水平降低。2．4 RT－PCR 檢測各實驗組大鼠肝臟組織IL－6 mRNA的結果 外源性給予IL－6抗原干預，使A組大鼠肝臟的IL－6表達增加，僅與B組比較差異有統計學意義（P＜0．05）；見表3、圖1。表明外源性給予IL－6抗原、抗體對大鼠肝臟組織的IL－6mRNA表達有影響。

表2 干預前后各組組內的胰島素變化

表3 各組大鼠肝臟組織IL－6mRNA表達

圖1 大鼠肝臟組織IL－6mRNA RT－PCR擴增電泳結果

3 討論

胰島素抵抗和β細胞功能障礙是T2DM發病的兩大機制。然而胰島素抵抗也可以同樣程度的存在于許多無糖尿病人群中，因此單獨的胰島素抵抗不可能是T2DM的決定性致病因素。更多的事實表明，胰島特別是胰島β細胞的異常可能是T2DM發病的中心環節［1－2］。

近年來，一些臨床流行病學的研究發現T2DM患者血循環中的急性期反應產物和炎癥因子水平升高，存在自然免疫的激活和低度炎癥［3］；而且抗炎治療可以改善T2DM患者糖代謝異常、提高胰島素敏感性。

IL－6產生于多種不同類型的細胞，肝臟的IL－6主要由Kupffer細胞、內皮細胞分泌，并以旁分泌方式作用于肝細胞［4］，它既能刺激肝細胞合成急性期反應蛋白，又能引起再生反應，其作用主要通過IL－6受體活化細胞內一系列信號蛋白分子來實現。目前的研究現狀表明，IL－6是炎癥所導致的代謝綜合征的罪魁禍首。有研究報道，IL－6缺乏的大鼠血糖水平升高并有糖耐量減低，雌性大鼠的血脂升高［5］。Senn等［6］研究發現，IL－6能抑制胰島素信號轉導及胰島素作用。Rotter等研究發現，短時間（120分鐘）注射IL－6對大鼠肝臟、肌肉、脂肪的胰島素受體及胰島素受體底物磷酸化無影響［7］。Klover等［8］在對小鼠注射IL－6第5天時發現，血漿IL－6升高6倍，與肥胖狀態下IL－6水平相似（升高2－4倍）。另外，小鼠肝臟STAT（signal transducer and activator of transcription，信號轉導子和轉錄激活子）磷酸化增加，胰島素受體磷酸化下降60%，IRS－1和IRS－2磷酸化分別降低60%和40%。IL－6亦使葡萄糖激酶mRNA轉錄降低約40%，糖耐量試驗提示胰島素敏感性降低。Klover等［9］在對Lep ob小鼠注射IL－6中和抗體后發現，與對照組相比，IL－6缺乏的Lep ob小鼠胰島素受體自身磷酸化及蛋白激酶激活分別增加35%及50%，高胰島素正常血糖鉗夾試驗中，內源性葡萄糖生成抑制是對照組的2．8倍。這說明IL－6缺乏的小鼠胰島素敏感性有所改善，反映了IL－6在肝臟IR中的作用。

我們的實驗取T2DM大鼠的肝臟組織，在經過IL－6抗原、抗體等干預后，應用RT－PCR技術測定IL－6mRNA的表達，結果顯示，經IL－6抗原腹腔注射的糖尿病大鼠肝臟IL－6mRNA的表達明顯高于IL－6抗體腹腔注射組，但與糖尿病對照組及正常對照組之間的升高沒有統計學的意義，這表明IL－6抗原及IL－6抗體對于肝臟的炎性細胞因子表達有一定作用，即IL－6抗原可能能夠刺激肝臟的Kupffer細胞、內皮細胞等分泌IL－6，IL－6抗體也可能對抑制肝臟IL－6mRNA的表達起到不可忽視的作用。

同時，血清中的IL－6水平采用ELISA法測定也顯示IL－6抗原干預組較其他組明顯升高，而IL－6抗體腹腔注射的糖尿病大鼠與PBS腹腔干預的糖尿病和正常對照組大鼠之間沒有明顯差別，可以認為IL－6抗體的腹腔注射對于血清中的IL－6表達沒有顯著作用，而IL－6抗原的腹腔注射則會顯著增加血循環中IL－6的水平，但其具體機制還有待于進一步研究。此外，本實驗顯示IL－6抗體的干預能夠使糖尿病大鼠的胰島素水平降低。

采用ELISA法測定肝細胞膜上InsR，結果顯示糖尿病不同干預組間比較無統計學差別，僅有糖尿病組較正常組升高明顯。其機制可能與T2DM大鼠胰島素在肝臟作用減低，胰島敏感性下降，代償性引起高胰島素血癥和肝臟胰島素受體表達增加有關。

綜上，本實驗證實了慢性低水平炎癥是T2DM的發生發展的重要機制，IL－6等炎癥因子或免疫因素促使胰島素抵抗和β細胞功能衰竭。另外，本實驗存在可以改進的的地方，即造模前后脂肪乳灌胃劑量一致，可保證大鼠的持續高胰島素血癥、胰島素抵抗狀態、胰島素敏感性降低。因此，從另一角度而言，IL－6缺乏可能對T2DM大鼠胰島β細胞功能具有一定保護作用。慢性低水平炎癥在T2DM病生理過程中的重要地位，為今后T2DM病理機制研究和防治提供相應理論依據。

［1］Gerasi E．胰島素生成，胰島素分泌及2型糖尿病：問題的核心在于β細胞［J］．中華內分泌代謝雜志，2005，21（3）：194．

［2］趙家偉，馬鳳海，羅 梅，等．胰島β細胞胰島素抵抗的證據［J］．中華內分泌代謝雜志，2005，21（4）：4．

［3］Pickup JC．Inflammation and Activated Innate Immunity in the Pathogenesis of Type 2Diabetes［J］．Diabetes Care，2004，27（3）：813．

［4］Aldeguer X，Debonera F，Shaked A，et al．Interleukin－6from intrahepatic cells of bone marrow origin is required for normal murine liver regeneration［J］．Hepatology，2002，35（1）：40．

［5］Wallenius V，Wallenius K，Ahrén B et al．Interleukin－6deficient mice develop mature－onset obesity［J］．Nat Med，2002，8（1）：75．

［6］Senn JJ，Klover PJ，Nowak IA，et al．Interleukin－6induces cellular insulin resistance in hepatocyte ［J］．Diabetes，2002，51（12）：3391．

［7］Rotter Sopasakis V，Larsson BM，Johansson A，et al．Short－term infusion of interleukin－6dose not induce insulin resistance in vivo or impair insulin signalling in rat［J］．Diabetologia，2004，47（1）：1879．

［8］Klover PJ，Zimmers TA，Konians LG，et al．Chronic exposure to interleukin－6causes hepatic insulin resistance in mice［J］．Diabetes，2003，52（11）：2784．

［9］Klover PJ，Clementi AH，Mooney RA，et al．Interleukin－6depletion selectively improves hepatic insulin action in obesity［J］．Endocrinology，2005，146（8）：3417．