LPS溫控凝膠實驗性角膜基質炎動物模型的創建

宗方偉，郝筱詩，郝繼龍

（吉林大學中日聯誼醫院 眼科，吉林 長春130033）

臨床上，角膜炎癥是導致視力喪失的主要致盲原因。其致病機理復雜，感染性和免疫性因素相互交織，外在毒力和機體固有免疫反應互相影響；其誘發原因多樣，細菌、真菌、病毒以及其代謝產物等。角膜炎癥的動物模型對于研究其復雜的致病機理至關重要，是臨床和科研上不可或缺的研究工具。一直以來，角膜基質炎的動物模型最普遍的建立方法為基質內注射，或者是菌液，或者是提純的致病因子，例如內毒素脂多糖。此方法沿用以久，最早可追溯到1986年，很多炎癥反應中的作用機理因此被發現［1，2］。然而，此種方法有一種主要的缺陷，即是其炎癥反應不夠嚴重和持久。其原因一方面是由于實驗動物例如兔子等草食性哺乳動物由于其自然生活的習性，具有較強的創傷愈合能力。此外還有一個主要原因是注射的水溶液由于角膜內皮泵的作用很快的被代謝掉，不能長久的存留，其作用效果自然也不能持久［2－7］。因此，對于科研人員而言，很難用這種動物模型系統長久的進行機理性等觀察研究，例如在評價某些藥物的藥效及副作用時。客觀上，需要一種能夠更為嚴重且持久的角膜炎癥動物模型。本實驗中，我們設計了一種含有脂多糖的溫控凝膠，能夠原位存在，緩釋、持久的誘導炎癥反應。此凝膠具有溫度敏感性，在低溫時候是液態，當溫度升高，能夠迅速轉化為高粘滯性的凝膠。因此，可以以水溶液的形式很輕易的注射進角膜基質內，注射后又能夠成為凝膠長久存在。我們期待利用此種方法能夠建立起令人滿意的動物模型。

1 材料和方法

1．1 實驗動物及造模過程

本實驗采用新西蘭成年雄性白兔，體重2－2．5千克（北京大學動物中心提供）。本實驗的動物使用及處理符合視覺與眼科研究協會（ARVO）動物保護倫理規范。利用氯丙嗪與異丙嗪（1∶1，200μl／kg）肌肉內注射麻醉實驗動物［4，6］，麻醉后平置于拓普康眼科手術顯微鏡下。考慮到動物倫理因素，每只實驗動物僅使用其右眼。各個時間點的10只兔子隨機均分為兩組，用29G的微量注射器從角膜的周邊穿至中央，基質內注射LPS溫控凝膠或傳統的水溶液10μl，以角膜輕度隆起及注射區基質變白為注射成功標志［2，7］。造模24小時后，開始實驗觀察，并對角膜大體相及HE染色計數評分。

1．2 預實驗

盡管泊洛沙姆的生物相容性及安全性已經被廣泛認可，但為了證明其本身不會對角膜的炎癥反應產生影響，在預實驗中，我們首先設計了不含LPS的單純18%泊洛沙姆凝膠進行基質內注射，觀察14天。

預實驗：經過連續14天的觀察，注射泊洛沙姆空白凝膠后的角膜一直維持透明，無任何炎癥反應。證明泊洛沙姆凝膠本身有很好的生物相容性，不會引起或對角膜的炎癥反應產生影響，亦即不會對脂多糖的作用產生影響。

1．3 角膜大體相的評分標準及臨床觀察

造模后的1、3、7、14天，兩組動物模型在眼科手術顯微鏡下進行角膜炎癥浸潤及新生血管情況的照相及評分。其評分標準如下：

【角膜炎性浸潤】

0分 — 完全透明無混濁

1分—輕度混濁

2分 — 中度混濁，仍可透見虹膜紋理

3分 — 重度混濁，不能看清虹膜紋理，但仍可見虹膜

4分 — 極重度混濁，不能透見虹膜

【新生血管評分】

0分 — 角膜緣無新生血管

1分 — 小于1／4象限角膜緣出現新生血管，輕度充盈

2分 —1／4至1／2象限角膜緣出現新生血管，輕度充盈，或小于1／4象限角膜緣出現新生血管，但重度充盈

3分 —1／2至3／4象限出現新生血管，輕度充盈，或1／4至1／2象限角膜緣出現新生血管，但重度充盈

4分 — 全角膜緣出現輕度充盈新生血管，或大于3／4象限角膜緣新生血管重度充盈

5分—一至三個象限的角膜緣新生血管蔓延至角膜中央區，嚴重充血怒張

6分 — 接近全周邊的新生血管長入角膜中央，嚴重充盈充血

1．4 HE染色及炎性細胞計數

各時間點動物模型在角膜大體相照相后過量麻醉致死，迅速取下眼球，常規方法固定，取下角膜做冰凍切片，包埋于OCT中。切割7μm厚的角膜冰凍切片，半小時風干，室溫下丙酮固定30分鐘，PBS沖洗后，常規方法行HE染色。病灶區域內炎癥細胞在400倍的顯微鏡視野下行細胞計數。

1．5 統計學分析

所有的資料數據按均數±標準差表達，獨立樣本T檢驗分析，P＜0．05具有統計學意義。

2 結果

2．1 角膜炎性浸潤及新生血管

對比于傳統方法的LPS水溶液，LPS溫控凝膠顯示出明顯的持久、緩釋的特性。連續14天的觀察結果下，其建立了更加嚴重、持久的角膜基質炎癥動物模型。

造模1天后，兩組間動物模型的炎癥對比無明顯差別，甚至，某些傳統LPS水溶液組的角膜炎癥反應甚至要輕度重于LPS凝膠組，這可能是因為LPS在水溶液中彌散較快，在角膜基質中更早的誘發炎癥反應。盡管如此，在此后的3、7、14天的觀察中，LPS溫控凝膠組的炎癥反應均明顯嚴重于對照組。在造模3天后，對照組的角膜炎癥雖然也較前有所加重，但LPS凝膠組的炎癥反應加重更為明顯，相當部分的角膜出現了環行的灰白色浸潤，初起時僅是以弧形出現，后逐漸彌漫至環形，并開始自旁中央向角膜中央遷延。在造模7天后，對照組的角膜炎性浸潤大部分已消失，僅在角膜緣周邊殘留不同程度擴張的新生血管，且此新生血管均未延伸至中央。而在LPS凝膠組，角膜的炎性浸潤仍持續性加重，逐漸變成瓷白色混濁，不能透見虹膜。在3天時出現的弧形浸潤繼續加重，互相融合，并開始延伸至中央。相應的，其新生血管的差異也十分明顯。實驗組的新生血管粗大、充盈，隨著炎癥的進展自周邊遷延至中央。造模14天后，由于藥效的時限性和哺乳動物（兔子）對創傷的愈合反應逐步恢復，兩組動物模型的角膜炎性浸潤均已明顯減輕。所不同的是，對照組的角膜幾乎已完全恢復透明，而實驗組仍可見到輕度的混濁。盡管如此，在角膜殘存的新生血管上，仍可明顯看出兩者的不同。對照組的新生血管較少，僅限于角膜緣，且枝干都較細小，幾乎無充盈；而實驗組的新生血管粗大、充血，互相融合，大面積的向中央區延伸。

表1 角膜炎性浸潤的評分 （均數±標準差，n＝5）

表2 角膜新生血管的評分（均數±標準差，n＝5）

2．2 HE染色炎性細胞計數

角膜基質的炎性細胞數量反應了角膜炎癥的嚴重程度。在不同時間點的角膜組織切片炎性細胞計數結果，基本上和上述宏觀的大體相結果相對應。在造模1天后，兩組角膜切片中的炎性細胞數無明顯差異（P＞0．05），僅有少量炎性細胞出現，大部分是粒細胞。而在此后的3、7、14天時間點上，兩組的結果便出現了顯著的差異。LPS凝膠組的炎性細胞數遠遠的高于對照組（P＜0．01）。在造模14天后，對照組的角膜切片中，炎性細胞數已基本上回降至正常水平，而實驗組仍有大量炎性細胞存在，盡管跟第7天時對比已經明顯下降。此結果顯示角膜大體相炎癥程度和新生血管評分的差異性，代表了兩組動物模型在炎癥反應和免疫反應程度上的差異。

表3 角膜切片HE染色炎性細胞計數 （均數±標準差，n＝5）

3 討論

角膜的炎性浸潤是導致視力障礙的最為重要原因之一，尤其是在發展中國家，角膜盲僅次于白內障，位居致盲疾病的第二位。在角膜炎的病理進程中，角膜基質層的炎性反應是最為重要的一方面。感染性因素和機體的免疫相關因素相互影響，導致炎癥的不斷進展、惡化，例如角膜基質內基質金屬蛋白酶類在炎癥進程中的激活導致了基質纖維不斷溶解，排列紊亂，其結果是角膜失去了原來的透明性，視力嚴重喪失。細菌的內毒素脂多糖已被證明是主要的毒力因子，在既往的多次實驗中已被證實［1，3，8－10］。也因此，借助于 LPS誘導角膜的炎癥反應成為科研上常用的方法之一。

3．1 內毒素的基質內注射

目前為止，有很多種方法建立角膜炎癥的動物模型，例如深層縱向的切割、角膜上皮的刮除、角膜縫線法以及基質內注射等。眾多方法中，基質內注射的方法最為常用，因為其可最小程度上造成額外創傷，保持上皮細胞的完整性，對于研究單純的角膜基質層的反應機理較為重要（額外干擾因素最少）。角膜基質層的改變被證實是外來的感染性毒力因素和自身免疫反應的結果。盡管如此，此方法造成的基質炎動物模型不夠嚴重和持久，注射的水溶液被內皮泵迅速代謝，難以長久發揮作用，給科研和臨床上的研究帶來了困難。

3．2 泊洛沙姆溫控凝膠

泊洛沙姆作為一種惰性的高分子材料，其生物相容性非常好，作為助溶的佐劑已經在某些學科上應用于臨床，用于肌肉、血管內注射，某些藥物的緩釋劑型。在眼科領域，已有些研究人員嘗試將其配制進滴眼液，用以加強其粘附性［11－13］。本實驗中，我們利用其溫度敏感性的特性，制作成LPS凝膠進行角膜基質內注射，使原本不易存留的脂多糖得以持久、緩釋的作用，取得了令人滿意的效果。

3．3 角膜的炎性浸潤環

本實驗的LPS凝膠組中，很多動物模型出現了角膜的炎性浸潤環。最初是較小的、不完整的弧形浸潤，隨著炎癥進展逐漸發展成環形，且自周邊開始向角膜中央蔓延，最終導致了角膜的大片瓷白色混濁。相應的，新生血管也隨之長入中央。此動態過程清晰可見，反復出現于凝膠組的多例動物模型中，具有一定的代表性，而從未出現于傳統的LPS水溶液組中。在之后的角膜切片染色中，發現此環形的浸潤主要為中性粒細胞。我們推測此浸潤環的出現是由于中央區注射的LPS不斷誘導的炎癥反應和免疫反應的結果。中央區刺激原的持續存在，激活了角膜基質層內信號傳導通路等介質的釋放（如NF－KB途徑等），持續性的吸引中性粒細胞移行，自周邊向刺激源聚集，由弧形的浸潤灶融合成環形，自周邊蔓延至中央。借助于改良的LPS凝膠，我們可以清晰的、動態的看到這一全過程。

總而言之，本實驗借助于創新性的LPS溫控凝膠，對傳統的脂多糖水溶液基質內注射方法進行了改良，建立起了更為嚴重且持久的動物模型，取得了較為滿意的效果，為今后的科研工作提供了一定的方便。

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