HSP65在結核病血清學診斷中的應用前景初探

賴允鑫，楊江龍，沙 巍，肖洋炯，曾維宏，葉薇怡，季 萍，肖和平，王 穎＊，沈 浩

（1．上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所，上海200025；2．同濟大學附屬上海市肺科醫院，上海200433）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，M．tb）感染引起的傳染病，病原菌主要通過空氣經呼吸道傳播。結核病是目前僅次于AIDS的第二大傳染病殺手，2011年數據統計結果顯示全球新發結核病患者達900萬之多，死于結核病人數達140萬［1］；中國是全世界結核病高負擔的國家之一，2011年新增結核病人數達90－110萬，僅次于印度位居世界第二。因此，結核病的國內外防控形勢非常嚴峻。

結核病是目前臨床上診斷最為復雜的疾病之一，現有診斷技術在診斷的準確性和及時性上還存在一定的不足。例如，目前在臨床上常規使用的傳統結核診斷方法中，痰涂片抗酸染色法（sputum smear microscopy）只有在患者痰中M．tb含量很高的時候才能檢測為陽性，因此很容易出現假陰性；痰結核菌培養法（sputum culture test）能提供更高的準確性，被譽為結核病診斷的“金標準”，但此法周期長（三周至兩個月），培養成功率不高，可能延誤治療；胸部X射線只能檢測出肺部病變嚴重的患者（如空洞），而且常常與腫瘤相混淆；基于遲發型超敏反應的PPD皮試試驗則由于受檢者接種過BCG而出現假陽性，也很難區分潛伏感染和活動期結核病。上述傳統診斷方法的缺陷，使建立可靠高效的TB診斷新技術成為臨床上的迫切需要。

血清學診斷是目前臨床診斷中應用最為廣泛的方法之一，該方法具有操作簡便、快速、便于推廣、無需特殊精密儀器等優勢，并可以發展成自動化檢測，在腫瘤、自身免疫病、心血管系統疾病、感染性疾病中具有廣泛的運用。在結核病的血清學診斷方面，國內臨床上使用針對38kDa、16kDa和LAM 3種抗原的血清學應答水平作為結核病的輔助診斷指標［4，5］，但是其檢測的準確性和靈敏度還有待于進一步提高。事實上，世界衛生組織（WHO）在對68項有關商業化血清學試劑盒的研究作出評估后，發現這些試劑盒在靈敏度和特異性方面與結核病的臨床診斷還有一定差距［2］，因此，尋找新的可用于結核病臨床診斷的血清學標志物仍然是結核病研究熱點之一。

我們利用實驗室自行構建和表達的系列結核分枝桿菌抗原蛋白，采用間接ELISA方法比較篩查了活動期結核病患者與健康對照組血漿中針對結核分枝桿菌抗原的IgG和IgM水平，發現并探討了抗HSP65的IgG和IgM作為活動期結核病新的血清學標志物的可行性。

1 材料與方法

1．1 研究對象 本實驗研究對象包括50例活動期結核患者和30例正常對照，50例活動期結核病患者血漿樣本來自上海肺科醫院，已簽署知情同意書，臨床診斷基于發病史、體檢、胸部X射線、痰涂試驗陽性、分枝桿菌培養陽性等標準，患者基本信息與臨床病理特征見表1。30例正常對照組血漿樣本來自上海市健康體檢者，篩選的標準是不存在結核病史，不存在肺部感染。

表1 活動期結核病患者臨床與實驗室指標（n＝50）

1．2 試劑與材料 BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，咪唑購自生工生物，Ni－NTA His－Bind Resin購自QIAGEN公司，IPTG購自碧云天，超濾管購自Millipore公司，明膠購自Sigma公司，氨芐青霉素購自Biobasic公司，HRP標記的鼠抗人IgG二抗和山羊抗人IgM二抗均購自Southern Biotech公司，鼠抗His－Tag抗體購自CST公司，抗鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司，TMB底物購自BD公司，蛋白印跡顯影液購自Millipore公司。

1．3 方法

1．3．1 HSP65和38kD蛋白的表達與純化pET23b－HSP65和 pET15b－38kD 表達質 粒購 自BEI Resources公司，測序結果表明目的基因序列與H37Rv菌株的 HSP65（Rv0440）和38kD（Rv0934）序列完全一致。采用常規方法轉化BL21（DE3）PLySs后，獲得BL21（DE3）PLySs－pET23b－HSP65和BL21（DE3）PLySs－pET15b－38kD 表達菌株，接種200ml LB培養基（含50μg／ml氨芐青霉素）37℃，250rpm 搖至 OD值為0．4至0．6后，加入IPTG至濃度為0．4mM，在30℃，220rpm條件下誘導3h后，7 000g離心3min，收集沉淀；用20ml細 菌 裂 解 液 （PBS－1%Triton X－100－10% 甘 油－0．5mM EDTA）重懸菌體沉淀，超聲法充分裂解細菌；8 000g，4℃離心30min，取上清，經0．45μm過濾器過濾后，加入1ml Ni－NTA瓊脂糖微珠，4℃旋轉混合過夜；次日用含PBS－20mM咪唑緩沖液充分洗滌，離心棄上清，以去除未與Ni－NTA瓊脂糖微珠結合或結合不緊密的雜蛋白；用PBS－300mM咪唑緩沖液洗脫目的蛋白；采用10%SDS－PAGE電泳檢測純化蛋白純度，收集純度大于95%的純化蛋白經3kD超濾管超濾，去除咪唑等小分子；再經0．22μm過濾器濃縮過濾后，加入無菌甘油至終濃度為40%，BCA法測定濃度，并置于－80℃冰箱保存備用。

1．3．2 間接ELISA法檢測血漿中抗 HSP65和38kD抗體 將純化抗原經包被液（pH9．6碳酸鹽緩沖液：15mM Na2CO3／35mM NaHCO3，）稀釋至1μg／ml，每孔100μl加入平底96孔板，4℃包被過夜；PBST（PBS－0．05%Tween 20）洗滌3次后，每孔加入200μl PBS－1%明膠，37℃封閉1h；PBST洗3次后，每孔加入100μl血漿稀釋液（采用1%明膠／PBST經1∶100稀釋），37℃孵育1h；PBST洗滌6次后，用PBST－1%明膠緩沖液稀釋的HRP－抗人IgG（1∶20 000）和IgM（1∶20 000）二抗，每孔加100μl，37℃孵育1h；PBST洗6次后，每孔加入100μl TMB底物，避光反應15min，每孔加入50μl 2NH2SO4溶液終止顯色反應，測定OD450nm值。

1．3．3 蛋白印跡 采用蛋白印跡鑒定純化抗原的純度，純化蛋白抗原經SDS－PAGE電泳，半干印跡至硝酸纖維素膜（NC膜）上，經TBS－5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，與經TBST－5%奶粉稀釋的鼠抗His－Tag抗體（1∶2 000）4℃孵育過夜；次日，用TBST洗3次，加入經TBST－5%脫脂奶粉稀釋的抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1h，TBST漂洗3次，加入ECL顯色液顯影，Bio－Rad蛋白分析儀掃描；此外，為進一步分析純化抗原在血清學反應特異性，蛋白電泳和印跡轉移后，與經TBST－5%脫脂奶粉稀的血漿（1∶1 000）室溫孵育1h；加入 TBST－5%脫脂奶粉稀釋的 HRP－抗人IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，加入ECL顯色液顯影，Bio－Rad蛋白分析儀掃描顯色結果。

1．3．4 統計學分析 所有數據分析均采用Prism 5／Graphpad軟件。ELISA結果分析時陽性Cut－off值取健康對照組均值加兩個SD。兩組數據比較均運用Mann Whitney檢驗，取P＜0．05時差異有統計學意義。

2 結果

2．1 結核分枝桿菌抗原HSP65和38kD的表達純化 抗原HSP65和38kD經大腸桿菌原核表達純化后，15%的SPS－PAGE膠電泳后以考馬斯亮藍染色檢測表達抗原的純度和分子量。HSP65分子量大小為56．7kD，38kD大小為38．2kD，結果顯示（圖1A）兩個抗原均與預測蛋白分子量相同；同時兩種純化蛋白的純度均達90%以上。經BCA法測定 HSP65、38kD濃度分別為0．26mg／ml、0．2mg／ml，用于下一步的血清學分析。Western Blot結果顯示（圖1B）兩個抗原均為經 His－Tag標記的HSP65和38kD。

2．2 活動期結核病患者外周抗HSP65IgG和IgM水平分析 我們采用間接ELISA方法，以抗38kD的IgG為對照，分析了活動期結核病患者外周抗HSP65IgG的水平，結果顯示患者外周針對兩種抗原的IgG的水平均顯著高于健康對照組（圖2A）。對于HSP65，當我們以OD450nm＝0．5為反應陽性閾值時，所有活動期結核病患者以及6個健康人的IgG抗體均為陽性，其中56%的活動期結核病患者的IgG反應OD值大于2．0，表明抗 HSP65的IgG抗體在活動期結核病人的靈敏度相當高，當閾值為0．5時可達100%。對于38kD抗原，活動期結核病患者的IgG水平差異大，且IgG水平低反應（OD450nm＜0．5）的患者比例達26%。此外我們還檢測了抗HSP65和38kD的IgG1和IgG2抗體水平，結果表明活動期結核病患者針對兩種抗原的IgG1水平顯著也高于健康對照組，而IgG2則未能檢測到（數據未顯示）。

圖1 結核分枝桿菌抗原HSP65和38kD的表達和純化

IgM是感染早期產生的抗體，對感染的早期診斷具有重要意義，因此我們在檢測外周血漿抗HSP65IgG的同時，也檢測了其特異性IgM的水平。結果顯示（圖2B）兩種抗原抗IgM的水平均反應較低，并且患者外周血漿特異性IgM的水平低于健康對照組，其中抗HSP65IgM的水平降低具有顯著差異；而抗38kD IgM的抗體水平在兩組間沒有顯著性差異。

為了進一步驗證上述ELISA分析中針對兩種抗原的IgG反應的特異性，我們挑選了血清學反應為陽性的結核病人血漿和陰性的健康人血漿各一份進行蛋白印跡方法驗證。結果顯示（圖2C），ELISA檢測中反應陽性的病人血漿在蛋白印跡中能夠特異性地與HSP65和38kD反應，而ELISA反應為陰性的健康人血漿則未能與兩種抗原進行應答，由此表明我們所建立的ELISA分析方法的特異性和可靠性。

2．3 抗HSP65IgG抗體在結核病血清學診斷中的意義 ROC（Receiver Operating Characteristics）是分析生物標志物在疾病診斷中運用價值的重要方法；ROC曲線的 AUC（Area Under Curve）值越大，表明生物標志物的診斷意義越大。通過ROC分析活動期結核病患者和健康對照組IgG抗體反應的OD值（圖4），我們發現HSP65和38kD的ROC曲線的AUC值分別為0．978和0．982。因此，與38 kD一樣，抗HSP65IgG抗體對結核病的診斷具有良好的應用前景。

圖2 活動期結核病患者外周抗HSP65IgG和IgM抗體水平及其特異性分析

另外，我們還分析了抗HSP65和38kD的IgG抗體在結核病診斷中的靈敏度和特異性（表2）。當閾值設為健康對照組的均值加兩個SD時，抗HSP65IgG的靈敏度和特異性均為90%（OD閾值為1．04）；抗38kD IgG的靈敏度和特異性分別為88%和90%（OD閾值為0．33）；HSP65與38kD聯合診斷的靈敏度升高至96%，特異性為80%。當閾值為0．5時，抗 HSP65的IgG抗體的靈敏度達100%，特異性為80%；而抗38kD IgG的特異性達100%，靈敏度為76%，HSP65與38kD聯合診斷的靈敏度和特異性與HSP65單獨診斷時一樣，分別為100%和80%。因此，上述結果顯示抗HSP65IgG在診斷中具有和38kD相當的靈敏度，在結核病的血清學診斷中具有潛在的應用價值。

圖3 抗HSP65和抗38kD IgG抗體在結核病診斷中的ROC曲線分析

表2 抗HSP65和38kD IgG的檢測靈敏度和特異性比較

2．4 抗HSP65IgG水平與結核病患者臨床病理特征的相關性 通過收集結核病患者臨床資料，我們比較分析了抗HSP65和抗38kD IgG抗體水平與患者臨床病理特征的相關性，包括年齡、發病時間、治療時間、抗酸染色、痰菌培養以及PPD反應性等。結果顯示，抗HSP65和抗38kD IgG在空洞病變結核病患者中的平均水平均高于無空洞患者，其中抗HSP65IgG的水平差異具有顯著性；而抗38kD IgG則沒有統計學差異（圖4）。由于患者出現空洞往往和疾病的嚴重程度相關，上述結果提示抗HSP65的IgG抗體水平與結核病的嚴重程度存在一定的正相關性。

圖4 活動期結核病患者中空洞陽性患者與陰性患者之間抗HSP65IgG抗體水平的比較

2．5 抗HSP65IgG抗體在結核病血清學診斷中對抗38kD IgG的補充性 在上述結果基礎上，我們進一步分析了抗HSP65IgG是否對現有結核診斷標志物具有補充作用，為此，通過綜合分析同一患者中抗HSP65和38kD IgG水平，我們發現（圖5），6個38kD IgG抗體陰性的結核病患者中，4個為抗HSP65IgG陽性；相反，5個抗HSP65IgG水平陰性的活性結核病患者中有3個是38kD IgG抗體陽性的，如表2結果所示，HSP65與38kD組合后（閾值為至少一個為陽性）能進一步提高檢測靈敏度，本研究所測定的抗HSP65IgG可以作為目前商業化應用的針對38kD的抗體應答水平檢測的補充，從而進一步提高診斷的靈敏度。

圖5 抗HSP65與抗38kD IgG水平在結核病患者中的相關性

3 討論

盡管近年來結核病的防控取得了一定的效果，但由于艾滋病的蔓延及耐多藥結核病例的增長，在發展中國家，尤其是非洲和亞洲國家，結核病帶來的公共衛生壓力依然巨大［1］。因此我們仍需要在結核病的診斷、治療和疫苗開發等方面做深入的研究。尤其在診斷方面，縮短時間和提高準確率（包括結核病的類型）能為結核病的早期治療以及治療方式提供依據，從而及時防止疾病的進一步擴散。相對于傳統的結核病診斷技術，近年來出現的關于結核病診斷的新技術，比如基于PCR原理的Xpert－MTB／RIF能快速診斷耐多藥結核病，但是該方法無法區分結核分枝桿菌的死活；基于特異性抗結核分枝桿菌細胞免疫應答的T－SPOT和Quanti－FERON方法（干擾素釋放實驗）是目前公認的較為準確和特異性的診斷手段，但是該方法價格高，操作具有一定的技術要求，同時不易區分結核分枝桿菌潛伏感染和活動性結核。所以，尋找更多的可用于臨床診斷的新技術和新方法還是當前結核病研究中的重要內容。

血清學診斷具有簡單、快速、高通量等優勢，但其前提是要尋找獲得特異性的血清生物標志物。血清學生物標志物根據其來源可以分為病原菌來源或是宿主來源，前者主要指來源于病原菌的抗原成分，如乙肝病毒感染后的HBsAg抗原；而宿主來源的血清生物標志物則是宿主在抗病原菌免疫應答中所產生的標志物。在結核病中，人體感染M．tb后，宿主免疫系統與M．tb的相互作用必然會產生特異的細胞免疫和體液免疫應答產物，如細胞因子、抗體等，其中有些分子就可能成為結核病的重要診斷指標，目前廣泛應用的基于M．tb特異性抗原刺激引起的IFN－γ釋放試驗，如T－SPOT．TB等方法即是成功例子；但由于個體間差異以及M．tb病原菌的多樣性等，這些試驗在實際應用中存在靈敏度不夠高、無法區分活動期與潛伏期感染等缺陷，因此尋找新的結核病免疫學標志物的研究仍然是全世界結核病研究人員關注的熱點，一些新的免疫應答分子正在被關注，如Novel NC等研究發現人的全血在體外經M．tb抗原Rv0081刺激后產生的IL－12（p40），IL－10和TNF－a在活動期結核病的診斷中靈敏度和特異性均為100%［19］，Ji Young Hong等用 M．tb特異性抗原ESAT－6、CFP－10和 TB7．7刺激人的全血后檢測上清中趨化因子IP－10的含量，發現IP－10能作為候選標志物用于活動期結核病的診斷，并且在活動期結核病患者血清中的IP－10含量比潛伏期感染者的高，因此血清IP－10能作為其他標志物的輔助用于結核病的診斷［20］；此外，血清IDO活性高低和肺結核的預后密切相關［23］；外周mi－29a也與活動期結核病相關［24］。

基于體液免疫應答的病原菌特異性抗原／抗體的血清學檢測在臨床疾病中得到廣泛應用，目前常用的商業化的結核病血清學診斷試劑盒及所用抗原有Pathozyme TB complex plus（38kD和16kD），Pathozyme Myco （38kD、LAM），MycoDot（LAM），Anda－TB （A60），TB glycolipid Assay （6種M．tb細胞壁糖脂）等，這些試劑盒的平均靈敏度一般都在80%以下，但特異性基本都在90%以上［2］；同時還可以檢測血清或其他體液（尿液、胸水等）中相關 M．tb抗原，如 LAM、ESAT－6、Ag85復合物等；其中對LAM的研究最為詳細，HIV陽性的結核病患者尿液中LAM檢出率為47%，但HIV陰性患者則只有14%［22］。雖然全球至少有73家生產商生產和銷售不同的結核病血清學診斷試劑盒，但這些試劑盒中的診斷效果還有待于進一步提高［21］。

本研究發現的抗HSP65IgG有可能成為新的活動期結核病血清學候選標志物。HSP65屬于HSP60家族，該家族在原核和真核生物中高度保守，能輔助正常或者應激條件下機體內蛋白質分子的正確折疊［9］。在原核生物中，HSP60又稱為GRoEL，一般細菌基因組只含有一個GRoEL基因，而分枝桿菌屬含有GRoEL1和GRoEL2兩個基因，后者即為HSP65［10］。在應激條件下，結核分枝桿菌可大量表達保守性抗原，并分布于胞內、莢膜，以及分泌至胞外。在機體抗M．tb免疫中，HSP65扮演著重要角色：分布在 M．tb莢膜層的HSP65分子能促進M．tb與巨噬細胞的相互作用［11］；促進樹突狀細胞對病原菌抗原的交叉遞呈［12］。HSP65還能誘導很強的T細胞和B細胞應答，M．tb免疫過的小鼠體內存在的M．tb特異性T細胞中20%是HSP65特異性的［13］；而40%的麻風病人體內存在大量的抗HSP65抗體［14］。有報道在結核病患者的胸水［6］和結核性腦膜炎患者的腦脊液中［7］都檢測到了抗原HSP65。但至今還沒有研究報道過抗HSP65的抗體在結核病血清學診斷中的作用。我們研究結果發現90%的活動期結核病患者血漿中都能檢測到抗HSP65IgG抗體，而且空洞陽性患者的抗HSP65IgG抗體明顯高于空洞陰性患者，提示該抗體與患者體內的細菌載量或病情的嚴重程度呈正相關。

血清學診斷在細菌性感染疾病中應用則受到很大的限制，這可能是因為和病毒來源的抗原種族特異性相比，細菌性抗原與其他細菌甚至宿主蛋白存在結構同源性。本研究中的分枝桿菌抗原HSP65與人HSP60蛋白的氨基酸序列存在47%同源性，因此人體感染M．tb后可能會引起針對自身抗原HSP60的免疫反應。HSP65反應性T細胞與自身抗原HSP60的交叉反應可能是類風濕性關節炎的發病機制之一［15－17］。但競爭ELISA試驗表明人血清中的抗HSP65的IgG抗體不與HSP60交叉反應，反過來抗HSP60的IgG抗體也不與HSP65反應［18］。因此，HSP65可以作為候選抗原用于結核病的血清學診斷應用。

綜上所述，本研究通過間接ELISA方法比較分析活動期結核病人外周抗HSP65IgG和IgM的水平，結果顯示HSP65作為一種重要的結核分枝桿菌病原菌抗原，其所誘導的體液免疫應答在結核病血清學診斷中具有應用潛力，上述研究也為開發新的多抗原聯合的血清學診斷試劑盒提供了新的候選靶抗原。

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