鹿茸多肽對缺血動物模型心肌細胞線粒體凋亡相關基因蛋白Bcl-2/Bax的影響

趙天一,姜彤偉,張永和

（長春中醫藥大學,吉林長春 130117）

鹿茸是名貴的動物藥,多肽中含有多肽、多糖、生長因子等多種成分,近年來,有研究[1]顯示,鹿茸多肽對心肌缺血有保護作用,能減少心肌缺血面積,調節心肌細胞膜和微粒體膜的穩定性,避免鈣離子內流引起細胞超負荷,以減輕心肌細胞損傷。但其對是否抑制細胞凋亡并不清楚。心肌梗死和急性心肌缺血等疾病與心肌的細胞凋亡有關[2],本實驗通過觀察鹿茸多肽對心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡相關基因Bcl-2和Bax蛋白的影響,探討其對心肌缺血大鼠的保護作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠,體質量（220±20）g,60只,雌雄各半,由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,合格證號為:SCXK（吉）2011-0004。

1.2 實驗試劑 鹿茸多肽（分子量3 000 Da-10 000 Da）凍干粉,由長春中醫藥大學研發中心提供,批號:20120302。維生素C丸,由東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產,批號:120301。注射用青霉素鈉,由華北制藥股份有限公司,批號為X1112413。Bcl-2和Bax蛋白酶聯免疫試劑盒由南京建成科技有限公司出品,批號為:20120603。

1.3 實驗儀器 FSH-2A型可調高速勻漿機為江蘇省金壇縣望華科教儀器廠出品,BIO RAD-680型酶標儀由日本出品及德國Biofuge stratos型臺式高速冷凍離心機。

2 實驗方法

2.1 動物模型的復制 大鼠以乙醚吸入式麻醉,胸部備皮去毛消毒,圍繞正中線做荷包縫合,正中線作約2 cm長的縱向切口,鈍性分離胸大肌,暴露胸骨、肋骨,用小拉鉤將4、5肋間分開,完全暴露心臟,剝脫心包膜,以左心耳與動脈圓錐之間的靜脈為標志,將左冠狀動脈前降支用縫合線結扎,心臟放回胸腔,擠出空氣,逐層關閉胸腔,縫合外皮,等待蘇醒[3]。假手術組動物未結扎左冠狀動脈前降支,其余手術步驟與模型組相同,其它各組與模型組手術相同。手術后連續3 d內腹腔注射青霉素注射液。造模后第2天,選造模成功的大鼠,雌、雄各隨機分為 6組,假手術組,模型組,維生素C對照組,鹿茸多肽高、中、低劑量組各10只。

2.2 給藥 灌胃給藥21 d,給藥體積為1 mL/100 g,鹿茸多肽高、中、低劑量組劑量分別是0.016、0.008、0.004 g/kg,維生素C陽性對照組給藥劑量為0.043 g/kg,假手術組、模型組給予同體積的蒸餾水。

2.3 心肌細胞線粒體相關蛋白的提取 灌胃給藥第21 d,給藥后1 h,以20%烏來糖注射液腹腔注射麻醉,給藥劑量為1 mL/100 g。取下心臟,用生理鹽水沖洗,剔除心房及右心室,留下左心室,取心尖組織200～300 mg,生理鹽水沖洗,用濾紙吸去水分,剪碎,稱取200 mg,加4℃生理鹽水至2 mL（心肌組織含量為10%）,在冰浴4℃條件下,用高速勻漿機以1.5～1.6萬r/min勻漿,每次10 s,間隔30 s,分5次;離心（2 000 r/min,10 min,4 ℃）,取出上 清;離 心（10 000 r/min,15 min,4 ℃）,去上清,取沉淀;稱重,加4℃生理鹽水（沉淀含量為 10%）,以1.5～1.6萬r/min勻漿,每次5 s,間隔10 s,分5次,分裝備用。

2.4 Bcl-2和Bax基因表達檢測 按試劑公司提供的試劑盒操作說明操作,測定心肌細胞線粒體中凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白的含量。

3 實驗結果

心肌細胞線粒體內凋亡相關Bcl-2、Bax蛋白表達結果顯示,與假手術組比較,模型組的Bcl-2蛋白表達減少,Bax蛋白表達增加（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01）。與模型組比較,鹿茸多肽高劑量組和鹿茸多肽中劑量,心肌細胞線粒體中Bcl-2蛋白表達增加,Bax蛋白表達減少（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值高于模型組（P<0.01,P<0.01）,低劑量組與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果提示,對心肌細胞損傷時細胞凋亡蛋白表達有調節作用,其作用可能通過調節抗凋亡蛋白因子（Bcl-2）和促凋亡因子（Bax）的表達水平,對心肌細胞損傷起一定的保護作用。結果見表1。

表1 心肌細胞線粒體中Bcl-2和Bax蛋白表達（±s,n=10） ng/mL

表1 心肌細胞線粒體中Bcl-2和Bax蛋白表達（±s,n=10） ng/mL

注:與假手術組相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01。

組 別 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax比值假手術組 4.15±0.69 8.62±2.28 0.49±0.12模型組 3.42±0.63Δ 10.98±1.49Δ0.33±0.12ΔΔ維生素C陽性對照組 4.15±0.63#8.58±1.49#0.50±0.12##鹿茸多肽高劑量組 4.13±0.54#8.46±1.66#0.51±0.12##鹿茸多肽中劑量組 3.99±0.40#8.72±1.78#0.47±0.07##鹿茸多肽低劑量組 3.79±0.32 9.38±1.04 0.41±0.05

4 討論

心臟活動消耗的大量能量來自于細胞內的線粒體的供能物質ATP,心肌細胞缺血首先累及是線粒體,引起心肌細胞能量代謝障礙。線粒體DNA作為唯一的核外遺傳物質,在細胞能量代謝上起著重要的作用,由于缺乏組蛋白,蛋白編碼區密集無內含子,加之與電子轉運鏈相鄰,線粒體DNA極易受到氧化應激的損傷,而導致細胞凋亡。Bcl-2家族在細胞凋亡過程中起著至關重要作用,Bcl-2家族基因所表達的蛋白也成為判斷細胞凋亡程度的一個檢測指標[4],Bax是一種重要的促凋亡蛋白,而Bcl-2作為抗凋亡蛋白,二者的表達水平受到相關基因的調控。其中,抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax在細胞內的含量,也成為判斷細胞凋亡程度的關鍵。而Bcl-2/Bax比值與細胞是否凋亡也有關,比值增加細胞凋亡會受到抑制,比值降低細胞凋亡反而增多。

據研究顯示[5],鹿茸多肽對心肌缺血大鼠有緩解作用,而其機制尚未清晰。本實驗用生化檢測法,對心肌缺血大鼠心肌細胞線粒體內的Bcl-2、Bax蛋白的表達進行了檢測,結果顯示,模型組大鼠的Bcl-2蛋白表達下降,Bax蛋白表達上升,Bcl-2/Bax比值降低。與模型組比較,鹿茸多肽高、中劑量組心肌線粒體中Bcl-2蛋白的表達增強,Bax蛋白的表達減少,Bcl-2/Bax比值也明顯增加,且具有統計學意義;鹿茸多肽低劑量組Bcl-2蛋白的表達增強,Bax蛋白的表達減少,Bcl-2/Bax比值增加,但不明顯。表明鹿茸多肽對大鼠缺血心肌損傷具有上調Bcl-2蛋白表達,和下調Bax蛋白表達的作用,從而對心肌缺血而引起的心肌細胞凋亡有抑制作用,對于減輕心肌細胞損傷有積極的意義。

綜上所述,鹿茸多肽對心肌細胞的保護作用機制可能與它通過抑制對線粒體中相關促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的含量調節,抑制凋亡過程的啟動,從而對心肌細胞中的線粒體起保護作用,達到保護心肌細胞的目的。

[1]陳曉光,王巖等.鹿茸多肽對異丙腎上腺素誘發大鼠心肌損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床,2009,25（2）,64-66.

[2]謝志泉.細胞凋亡與缺血性心臟病[J].心血管病學進展,1999,20（5）:279.

[3]施新猷.醫學動物的實驗方法[M].北京:人民衛生出版杜,1989:336.

[4]Cook SA,Sugden P H,Clerk A.Regulation of bcl-2 family Proteins during develoP ment and in resP onse to oxidative stress in cardiac myocytes[J].Circ Res,1999,85（10）:940-949.

[5]張永和,黃曉巍.鹿茸醇提物對心肌梗死模型大鼠心肌損傷的保護作用及對血漿內皮素含量的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14（1）:40-41.