超高壓處理對牛初乳中微生物的影響

任 杰，胡志和，劉 洋

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

牛初乳是母牛提供給新生牛犢用來抵抗外來微生物的一種乳品，其含有豐富的優質蛋白質、維生素和礦物質等營養成分[1]，同樣富含免疫球蛋白、生長因子等活性功能組分[2-3]，能消滅侵入人體的致病原[4]，抑制病菌繁殖，是一種能增強人體免疫力、促進組織生長的功能性健康食品[5-6]。大量研究證明，牛初乳是除人初乳外惟一富含生長因子和免疫因子的天然食物，被認為是替代人初乳的最佳乳品[7]。然而近年來，由于污染致病菌而引起的乳品中毒事件常有發生[8-9]，使得乳品安全問題成為了人們關注的焦點。尤其是存在于乳中的金黃色葡萄球菌是引起我國食物中毒的主要病原菌，它能殺死白細胞素，引起人的化膿性感染、肺炎、偽膜性、腸炎和膿毒血癥等疾病[10]；而且它一旦進入人體，腸毒素會引起急性胃腸炎，這已成為世界性的公共衛生安全問題[11-13]，血漿凝固酶會造成局部化感染[14]，溶血毒素會引起局部缺血甚至壞死[15]。乳品中的微生物含量是衡量其品質好壞及貨架期的關鍵因素。超高壓處理（ultrahigh pressure processing，UHP）作為物理作用的非熱殺菌技術[16]，能夠殺滅微生物，保留食品的天然色澤、香氣成分與營養價值等[17]，同時還能夠增強乳蛋白的可消化性[18]。超高壓技術結合冷凍干燥生產牛初乳，可克服傳統加工方式的缺陷，改善牛初乳制品的生物安全性，提高其質量。本實驗以滅菌壓力、保壓時間和溫度為因素，研究超高壓處理對牛初乳中微生物的影響，初步確定牛初乳超高壓滅菌的工藝條件，為超高壓技術在牛初乳中的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 由德興隆有限公司提供；蛋白胨、酵母膏等生化試劑 北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉、葡萄糖等生化試劑 天津市元立化工有限公司；NaOH、NaCl等試劑 天津市化學試劑批發公司；微生物測試紙 廣州綠洲生化科技有限公司。

HPP.L3-600/0.6型超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；SW-CJ-1F型博訊超凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LRH-70型生化培養箱 上海一恒科技有限公司；Astor 20菌落計數器 深圳菲特立科技有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；塑料薄膜封口機 浙江江南實業有限公司。

1.2 牛初乳的超高壓處理

量取5mL左右的生鮮牛初乳裝于聚乙烯塑料袋內，真空密封后進行超高壓處理，檢測處理前后的菌落總數和金黃色葡萄球菌數量。

1.2.1 壓力對牛初乳中微生物的影響 溫度維持在30℃，保壓時間20min，壓力分別選取100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa處理牛初乳，以未經高壓處理的樣品作為空白對照組，檢測樣品中菌落總數和金黃色葡萄球菌數量。

1.2.2 保壓時間對牛初乳中微生物的影響 在壓力350MPa，溫度為30℃，不同時間（10、20、30、40、50、60min）下處理牛初乳，空白對照組為未經高壓處理的樣品，檢測處理前后樣品的菌落總數和金黃色葡萄球菌的數量。

1.2.3 溫度對牛初乳中微生物的影響 在壓力為350MPa，保壓時間20min，溫度分別選取10、15、20、25、30、35、40℃處理牛初乳，未經高壓處理的樣品為空白對照組，測定樣品中的菌落總數和金黃色葡萄球菌數量。

1.2.4 超高壓殺菌條件優化 選用處理壓力、作用溫度和保壓時間作為實驗因素，進行L9（34）正交實驗，同時將未經高壓處理的牛初乳作為空白對照組，篩選微生物致死率較高的壓力、溫度和時間組合。正交實驗設計見表1。

表1 L9（34）因素水平表Table 1Factor-level design L9（34）

1.3 微生物的檢測

菌落總數的測定根據國家食品微生物檢驗標準GB 4789.2-2010進行，金黃色葡萄球菌的檢測采用測試紙片法，將處理好的樣品吸取1mL接種于測試紙片上，將上層膜緩慢蓋下，待培養基凝固后，再將測試紙片疊放在一起放回原自封袋中并封口，置于恒溫培養箱中培養。培養溫度為（36±1）℃，培養15～24h。每個樣品檢測三次，取其平均值進行計算。

1.4 致死率的計算

致死率（%）=（對照組的平均菌數-處理后樣品的平均菌數）/對照組的平均菌數×100

式中：對照組的平均菌數—在常壓下所測得的菌落總數平均值或金黃色葡萄球菌的平均值，此時的致死率為0；處理后樣品的平均菌數—牛初乳經超高壓處理后所測得的菌落總數平均值或金黃色葡萄球菌的平均值。

1.5 數據處理

數據分析和圖表制作利用軟件Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 壓力對牛初乳中微生物的影響

在溫度為30℃、保壓時間為20min的條件下，采用不同的壓力處理牛初乳，結果如圖1所示。

由圖1可知，隨著牛初乳所受壓力的增加，滅菌效果也越來越好，說明超高壓對金黃色葡萄球菌與菌落總數的作用效果一致。菌落總數的致死率曲線顯示，當壓力從常壓增加至300MPa時，滅菌效果非常明顯，菌落總數由原來的1.3×107減至1.8×106，下降了一個數量級，菌落總數的致死率呈上升趨勢，壓力對菌落總數的影響基本遵循一級反應動力學模型；當壓力增加至400MPa時，滅菌曲線的上升趨勢逐漸趨于平緩；當壓力超過400MPa時，牛初乳中的菌落總數致死率達到95.6%，細菌總數下降到5.7×105；壓力增至550MPa時，未檢測到微生物，致死率達到100%。

由金黃色葡萄球菌的致死率曲線可得，當樣品所受壓力不超過300MPa時，隨著所施壓力的升高，金黃色葡萄球菌的數量由原來的5.0×104減至1.2×102，金黃色葡萄球菌的致死率呈直線上升趨勢；當壓力達到或超過400MPa時，致死率達到了100%。

超高壓滅菌的原理在于高壓使得微生物的細胞形態、遺傳機制以及組織結構等都發生了改變[19]，對微生物的破壞作用主要集中于細胞膜和細胞壁[20-21]。研究表明，壓力會導致細胞膜的通透性發生改變[22-23]，繼而生物大分子的立體構象發生崩潰，高級結構被破壞，蛋白質凝固，酶的活性受到抑制，DNA等遺傳物質無法完成復制[24]，導致了微生物的死亡[25-26]。施加壓力越大，微生物細胞膜破壞的程度也就越嚴重，這與本實驗中隨著處理壓強的增大，致死率逐漸上升的趨勢是一致的。另外，Malicki.A等[27]的研究認為，在100～400MPa內，壓力的增大能顯著降低沙門氏菌的存活率，王蕊等[28]將生鮮牛奶置于14℃和430MPa的條件下施壓15min，發現細菌總數的致死率達到99.5%，這些都說明了隨著施加壓強的增大，滅菌的效果越好。

綜上，選擇450、500和550MPa進行下一步的正交實驗。

2.2 保壓時間對牛初乳中微生物的影響

在壓力為350MPa、溫度為30℃的條件下，采用不同的保壓時間處理牛初乳，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著保壓時間的延長，無論是菌落總數還是金黃色葡萄球菌，兩者的致死率都逐漸上升。從菌落總數的致死率曲線圖可以看出，當保壓時間增至20min時，致死率明顯上升，曲線呈線性變化；當保壓時間超過30min后，菌落總數的致死率增幅趨于緩和；在50min時，致死率為98.2%；在60min時，致死率為100%。

從金黃色葡萄球菌的致死率曲線圖可以看出，當保壓時間在20min內時，隨著時間的延長，金黃色葡萄球菌致死率的曲線較陡，上升趨勢顯著；繼續延長保壓時間，致死率雖在上升，但增加幅度變得平緩；當達到60min時，金黃色葡萄球菌致死率達到100%。

Gaenzle M G等[29]利用熒光染色技術對超高壓破壞大腸桿菌細胞膜研究發現，不可逆的膜損傷與保壓時間長短有關。在多數情況下，保壓時間越長，超高壓滅菌的效果越好，但是隨著保壓時間的增加，其對滅菌效果的貢獻卻越來越小，即當保壓時間達到一定值時，其對滅菌效果已基本沒有太大影響。夏元景等[30]也證實，當壓力、pH等因素固定，達到一定時間后，延長保壓時間，微生物的致死率將趨于平緩。這些都與圖2的曲線變化圖相一致：在一定的時間范圍內，致死率隨著時間的延長而上升；超過一定范圍后，繼續延長時間，則致死率變化不大。

綜上，選擇15、20和25min進行下一步的正交實驗。

2.3 溫度對牛初乳中微生物的影響

在壓力為350MPa、保壓時間為20min的條件下，采用不同的溫度處理牛初乳，結果如圖3所示。

圖3顯示，溫度對牛初乳中細菌總數的致死作用并非呈線性相關關系，而是出現了上下波動。當溫度小于20℃時，致死率隨溫度升高而下降；在20℃時致死率最低，超高壓處理的結果最差，致死率僅為33.3%；當溫度超過20℃時，致死率隨溫度升高又呈現上升的趨勢；當溫度升高到35℃時，細菌總數的致死率超過95%；40℃時達到100%的致死率。

對于金黃色葡萄球菌，致死率曲線的變化趨勢與細菌一致，亦是在20℃時最低。當溫度低于20℃時，隨溫度升高，致死率逐漸下降；當溫度大于20℃時，隨著溫度升高，致死率逐漸上升；到30℃以后趨勢變緩；在35℃時達到100%的致死率。

超高壓處理乳制品應該在適當溫度范圍內進行。在低溫條件下，超高壓處理易導致細胞因冰晶析出而加劇破裂，蛋白質會對高壓更加敏感而容易發生變性，微生物的細胞膜結構也受到損傷，這些都導致了微生物耐壓性降低，而且在一定范圍內溫度越低，對微生物的損傷也越嚴重[31-32]；這就是圖3中溫度越低、致死率越高的原因。在較高溫度范圍內，溫度與超高壓的處理效果有協同作用[33]，適當的提高溫度，可降低處理壓強，亦可達到同樣的滅菌效果。升溫改變了微生物細胞膜的流動性，減弱了那些連接生物大分子非共價鍵之間的作用力，從而加速了高壓處理微生物的滅菌效果，使得致死率隨著溫度的升高而增大[34]。超高壓的滅菌效果優于熱處理的滅菌效果，且在保留乳品原有特性方面優于熱處理[35]。

綜上，選擇30、35和40℃進行下一步的正交實驗。

2.4 超高壓處理牛初乳對微生物致死條件的優化

由表2中菌落總數的相關數據，分析k值可知，最優組合為A3B3C3，即為550MPa、40℃、25min；由極差分析結果可知：RA＞RB＞RC，因此上述三個影響因素對微生物滅菌效果的作用大小順序為：壓強大小＞施壓溫度＞保壓時間；對金黃色葡萄球菌的相關數據值可知，A、B、C各自三個水平中只有第一個水平數比較低，另外兩個水平的作用效果是一致的，即A1＜A2=A3，B1＜B2=B3，C1＜C2=C3。而且極差分析的結果顯示：壓強、溫度、時間這三個因素對于超高壓殺滅金黃色葡萄球菌的作用效果是一致的。

因此，由正交表分析可得，超高壓處理牛初乳最優組合為A3B3C3，即為550MPa、25min、40℃，經驗證在此條件下，菌落總數和金黃色葡萄球菌的致死率均為100%。但在實驗中，其他致死率達到了100%的條件亦為優化條件：A3B1C3、A3B2C1、A1B3C3、A2B3C1、A3B3C2，即：550MPa、30℃、25min，550MPa、35℃、15min，450MPa、40℃、25min，500MPa、40℃、15min和550MPa、40℃、20min。

3 結論

單因素壓強組的實驗中，在一定范圍內，隨著處理壓力的增大，菌落總數和金黃色葡萄球菌的致死率曲線均呈上升趨勢。但當壓力超過一定范圍后繼續增大，則對殺菌效果影響不大；施壓溫度對殺菌效果也有顯著的影響，溫度過低或過高都會促進超高壓對菌落總數和金黃色葡萄球菌的殺滅作用；保壓時間也影響超高壓處理對微生物的殺滅效果。延長保壓時間，會提高菌落總數和金黃色葡萄球菌的致死率，但時間超過一定范圍后則對滅菌效果沒有明顯的貢獻。

表2 超高壓處理牛初乳對微生物致死條件的優化結果Table 2 Conditions optimization results of microbial fatality rate in bovine coloctrum processed by UHP

增大壓強、延長保壓時間、提高施壓溫度均會增強超高壓處理對菌落總數和金黃色葡萄球菌的致死率。超高壓處理牛初乳的正交優化條件為：當壓力為450MPa時，施壓溫度≥40℃，保壓時間≥25min；當壓力為500MPa時，施壓溫度≥40℃，保壓時間≥15min；當壓力為550MPa時，施壓溫度≥30℃，保壓時間≥25min或施壓溫度≥35℃，保壓時間≥15min。

綜上所得，本研究采用超高壓技術殺滅牛初乳中的微生物，處理后牛初乳中菌落總數和金黃色葡萄球菌殘存很少，甚至未檢出，處理效果較好，可以為牛初乳飲品的生產提供參考。

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