大鼠黃褐斑動物模型的建立

蒲春霞，何海蓉

(成都大學醫護學院，四川成都，610106)

黃褐斑是一種多因素、多系統、多環節所致的色素性皮膚病，發病機理復雜，真正的發病原因目前尚不十分清楚，也無療效確切的中、西醫治療方案［1，2］。其作為一種色素增加性皮膚病，控制黑素生成是其治療的根本。黑素細胞合成黑素是一個非常復雜的過程，受到多種因素的影響。筆者根據黃褐斑的發生與內分泌紊亂有關及目前學術界通行的“雌激素和黃體酮增多進而刺激黑色素細胞而致色素沉著”的發病學假說［3］，用黃體酮注射液(孕激素)攻擊雌性大鼠，復制黃褐斑動物實驗模型，以期為探索其發病機制和治療方案提供基礎。

1 材料與方法

1．1 動物和試劑

SD大鼠，普通級，20只，體重220．6～250．0 g，雌性。供應單位:成都中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號:SCXK(川)2008-11，質量合格證號:NO．0006174。黃體酮注射液，規格:1 mL:20 mg，批號:091101，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，試驗時無需配制。超氧化物歧化酶(SOD)測試盒，批號:20100312，丙二醛(MDA)測定試劑盒，批號:20100408，南京建成生物工程研究所第一分所生產。酪氨酸標準品，規格:100 mg/支，批號:140609-200711，中國藥品生物制品檢定所出品。TP總蛋白測定試劑盒(雙縮脲法)，規格:6*50 mL，批號:1209071，四川省邁克科技有限責任公司生產。

1．2 儀器設備

DW-40L188型低溫保存箱(－40℃)，青島海爾科技有限公司;島津LC-2010AHT高效液相色譜儀;日本TMS-1024I型全自動生化分析儀，日本東京貿易醫療系統株式會社生產。

1．3 實驗方法

雌性大鼠20只，按體重隨機分為正常組、模型組，每組10只動物。模型組每日于大鼠后腿根部以7．5 mg/kg(相當于人用臨床劑量的3倍)肌肉注射20 g/L黃體酮注射液1次，正常組注射等體積注射用水，連續注射30 d。

1．4 觀察指標和檢測方法

1．4．1 血液流變性測定 末次給藥后次日，大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血3 mL，肝素(80×103 u/L)抗凝，測定血液流變性各指標。

1．4．2 肝臟、皮膚組織中酪氨酸含量測定 試驗大鼠取血后處死，取背部皮膚(脫毛)及肝臟各1塊，用預冷生理鹽水(4℃)沖洗，除凈雜質，濾紙拭干，切取皮膚、肝臟各0．5 g，分別放入盛有2．0 mL預冷生理鹽水的小燒杯內，剪碎后勻漿，勻漿液3 500 r/min離心15 min，取上清液在全自動生化儀上測定勻漿液總蛋白含量，用于計算每克組織中各指標含量或活性。

1．4．3 肝臟、皮膚組織中MDA含量和SOD活性測定 取上述勻漿上清液按說明書操作，采用試劑盒檢測肝臟及皮膚中MDA，SOD。按說明書公式計算MDA含量及SOD活力。

1．4．4 皮膚黑色素細胞的病理形態學檢查 末次造模給藥24 h后，麻醉、腹主動脈取血處死大鼠，取大鼠背部去毛皮膚1塊，Bouin液固定。常規石蠟包埋切片，片厚4 μm，載玻片經防脫處理后撈片、烘片。再經常規脫蠟至水，PBS水洗，以H2O2質量濃度為30 g/L的H2O2溶液封閉，用鼠抗人單克隆抗體HMB45(mdantmaa黑素瘤)為第一抗體，以ElivisionTMplus免疫組化方法顯示表皮中的黑色素顆粒，蘇木素染色，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察黑色素細胞在表皮中的分布及分泌功能情況，黑色素陽性目標用計算機進行圖象分析。在奧林巴斯BX41-32P02顯微鏡100倍窗口下，每片觀察5個不同視野，找到陽性目標(表皮和附件上皮細胞胞漿中出現棕色反應)并拍照后，用成都泰盟科技有限公司生產的BI-2000型圖像分析系統對目標圖象進行定量分析，計算其積分光密度、平均光密度、平均灰度、目標面積和分布密度。

1．5 數據統計處理

對皮膚及肝臟中的酪氨酸，MDA，SOD含量及皮膚黑色素細胞的積分光密度、平均光密度、平均灰度和目標面積進行正態性檢驗，符合正態性檢驗則進行方差齊性檢驗，然后選擇t檢驗進行統計，不符合正態性檢驗則采用非參數檢驗進行統計。

2 結果與分析

大鼠造模后，全血粘度均有明顯升高(P＜0．05)，其余指標除血漿粘度和紅細胞壓積外，也均有不同程度的升高，但無統計學差異(表1)。模型組大鼠組織酪氨酸含量均明顯升高(P＜0．05)(表2)。模型組大鼠肝臟SOD活力明顯降低(P＜0．05)，皮膚MDA含量明顯升高(P＜0．05)(表3)。大鼠黑色素細胞染色深淺度用灰度值和光密度值表示，顏色越深，灰度值越小，光密度值越大。積分光密度是平均光密度與面積的乘積，顏色越深，面積越大，積分光密度越高。造模后大鼠黑色素細胞平均灰度值明顯低于正常組，統計學有極顯著差異(p＜0．001)，平均光密度值、積分光密度值、目標面積和分布密度均明顯高于正常組，統計學有極顯著差異(p＜0．001)(表4)。

表1 黃體酮致黃褐斑模型大鼠血液流變性影響(x±SD)

3 結論與討論

黃褐斑作為彌漫性過度色素沉著，常伴內分泌失調，在垂體分泌促腎上腺皮質激素時，也分泌過量的黑色素細胞刺激素，因而皮膚黑色加深。黑色素過多的原因之一是由于皮膚黑色素產生過多，而酪氨酸酶在黑色素生物合成過程中起著極為重要的作用。酪氨酸酶是黑色素代謝中的關鍵酶，它可直接影響黑色素的合成［4，5］。其次，氧化與抗氧化失衡可能是產生黃褐斑的重要因素。氧自由基與皮膚黑色素的形成及色素沉著有關［6，7］。MDA可導致蛋白質分子發生交聯，形成熒光發色團色素。SOD除能有效清除自由基外，還具有抑制酪氨酸酶的活性，降低色素沉著的作用。大量資料表明，黃褐斑患者血中SOD和過氧化氫酶(CAT)活性顯著降低，LPO和MDA含量明顯增高。本研究表明，模型組大鼠組織酪氨酸含量均明顯升高;大鼠肝臟SOD活力明顯降低，皮膚MDA含量明顯升高，符合黃褐斑生物化學改變特征。

表2 黃體酮致黃褐斑模型大鼠組織中酷氨酸的質量分數(x±SD) mg·g－1

表3 黃體酮致黃褐斑模型大鼠組織中MDA和SOD含量(x±SD)

表4 黃體酮致黃褐斑模型大鼠黑色素細胞的變化(x±SD)

黃褐斑作為全身性疾病的局部反應，臨床資料研究表明黃褐斑患者存在血流動力學指標異常，認為血液流變學改變與黃褐斑關系密切［8］。本次研究檢測了血液流變學指標來考察模型是否成功。大鼠造模后全血粘度均有明顯升高，其余指標除血漿粘度和紅細胞壓積外，也均有不同程度的升高，表明該模型與臨床研究結果一致。

判斷黃褐斑動物模型是否成功最直接、客觀的指標，是皮膚病理學檢查黑色素沉著是否增多。本實驗結果顯示，模型組黑色素細胞較正常組明顯增多，呈強陽性反應。計算機病理圖象學定量分析結果，模型組黑色素著色面積、黑色素細胞數明顯大于正常組，黑色素著色深度也明顯增加，經統計學處理有顯著性差異。說明造模后大鼠表皮黑色素著色面積、深度明顯加大。

綜上所述，筆者認為用黃體酮注射大鼠復制的黃褐斑模型在臨床研究資料、生物化學、病理學指標方面均可靠。黃體酮刺激造成的機體內分泌紊亂不僅使合成黑色素的酪氨酸酶含量增加，它還可能使機體抗氧化能力降低，從而進一步增加酪氨酸酶含量，增加黑色素的生成。本次研究針對目前治療黃褐斑無確切有效的中西醫療法，建立了可靠的動物模型。

［1］周穎華．黃褐斑病因及發病機理［J］．中外醫學研究，2011，9(34):163-164．

［2］覃永健，馮穎穎．中醫治療黃褐斑研究述評［J］．中醫學報，2012，27(6):762-764．

［3］張海燕，王軍．黃褐斑實驗動物模型的應用研究概況［J］．中國民族民間醫藥，2009(8):41-42．

［4］周繼剛，汪鑒植，陳仁美，等．祛斑膠囊治療黃褐斑的實驗研究［J］．湖北中醫雜志，2006，28(5):15-17．

［5］馬景昕，涂彩霞，陳曉燕，等．中藥對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA水平的影響及致色素作用［J］．中華皮膚科雜志，2005，38(2):92-94．

［6］劉邦民，張涓，陶春榮，等．祛斑湯防治黃褐斑的實驗研究［J］．中藥藥理與臨床，2008，24(1):67-69．

［7］張子平，施秀明，劉茁，等．色素障礙性皮膚病患者血液SOD、LPO、GSH-PX、GSH測定及意義初探［J］．皮膚病與性病，1997，19(3):8-10．

［8］林新瑜，周光平，李利，等．女性黃褐斑患者的血清酶學及血液流變學初步分析［J］．臨床皮膚科雜志，1997，26(6):359-361．