海水反硝化細菌的篩選及其對氨氮、亞硝態氮的降解性能

劉 芳

(西北農林科技大學，陜西楊凌，712100)

隨著高密度工業化水產養殖業的發展，餌料殘體、養殖動物的大量糞便和分泌物的積累，使養殖水體中的-N和-N等含氮污染物濃度日益增加，導致養殖動物易于患病甚至死亡，降低了養殖動物的總產和單產、增加了養殖成本，這已成為限制水產養殖業可持續發展的重要原因之一［1］。在養殖過程中，為了要保證水溫和各種條件的穩定，也為了降低成本，不希望頻繁大量換水。所以，在這樣一個相對密閉的水環境中，如何高效及時的去除各種含氮污染物，特別是去除對養殖動物有強烈毒性的-N和-N［2］，是當前急需要解決的關鍵問題之一。

目前關于淡水中各種氮的去除已有大量文獻報道，也取得較大進展，而海水生物脫氮研究伴隨著海水養殖產業化的快速發展業已成為一個重要課題，在減輕及消除海水氮素污染方面擁有廣闊前景［3］。為了能夠更加有效地通過微生物去除水中的-N和-N，應該深入研究微生物在高密度和工業化水產養殖業中的應用，從而實現可持續發展的目的［4］。本實驗通過研究不同培養基分別接種的不同來源的菌種，從而篩選出對-N和-N具有較強的降解能力的菌種。并考察溫度、pH值、C/N對其降解氨氮、亞硝態氮性能的影響，從而對實際應用的可行性提供指導。

1 材料和方法

1．1 取樣地點及方法

分別從河北省昌黎縣黃金海岸海邊、秦皇島糧豐海洋生態科技開發有限公司養魚池、河北省昌黎縣蒲河口取海水500 mL，帶回放置冰箱冷藏室備用。

培養基用海水取自蒲河口(粗含鹽質量濃度為35 g/L)。

1．2 培養基

1．2．1 基礎培養基［5］葡萄糖 1．2 g，K2HPO40．5 g，KH2PO40．5 g，1/3 海水1 000 mL，pH 7．0，瓊脂粉20 g。

1．2．2 篩選培養基 在基礎培養基的基礎上分別加入:(1)NaNO21．0 g;(2)(NH4)2SO42．0 g;(3)NaNO21．0 g，(NH4)2SO42．0 g。配置成3 種篩選培養基。

所用試劑均為分析純。

1．3 菌體篩選

取3種不同來源的海水0．05 mL，在超凈工作臺處分別接種于3種不同的培養基平板。用無菌涂布棒涂布均勻。待樣品干燥后將培養皿倒置于恒溫培養箱中30℃培養。據菌落顏色及形態特征，挑取有代表性的單菌落，在相應培養基的平板上劃線純化，直至得到單菌落。將在固體平板上生長狀況良好的菌種每個挑2環接種到相應的液體培養基中搖瓶培養，每個搖瓶中裝液體培養基100 mL，3 d后對所培養菌種進行脫氮性能鑒定［6～9］。

利用篩選得到的反硝化細菌研究不同pH值，溫度，C/N條件下去除氨氮及亞硝酸鹽的能力。

培養基為基礎培養基+NaNO21．0 g，(NH4)2SO42．0 g;pH值用鹽酸調節，溫度采用不同的恒溫搖床，C/N為葡萄糖中的C與氨氮及亞硝酸鹽中的N之比。

1．4 亞硝態氮及氨態氮測定

采用水博士氨氮測試盒和亞硝態氮測試盒測定NH+4-N，NO－2-N的質量濃度以及監測搖瓶溶氧量(溶氧量2 mg/L ±0．3 mg/L)。

1．5 數據處理統計方法

運用Excel和DPS軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2．1 反硝化細菌的篩選

將3種不同來源海水分別接種于3種不同的培養基上之后，最終獲得了5個菌種。對獲得的5種菌分別取2 mL加入到相應的初始質量濃度分別為NH+4-N 200 mg/L，NO－2-N 150 mg/L的100 mL培養液中，經12 h后測得剩余NH+4-N 200 mg/L，NO－2-N的質量濃度如圖1所示，剩余質量濃度越低說明降解效果越好。結果表明:4號菌所在培養基中亞硝態氮的剩余質量濃度最低，僅0．5 mg/L，說明其降解亞硝態氮的能力最強;5號菌所在培養基中氨氮的剩余質量濃度最低，約在12 mg/L，說明其降解氨氮的能力最強;但2號菌所在培養基中剩余氨氮、亞硝態氮的綜合濃度是5種菌里邊最低的，說明2號降解亞硝態氮、氨氮的綜合能力最強，保留該菌種，進行后續試驗。

圖1 不同菌處理后氨氮和亞硝態氮的剩余質量濃度

2．2 pH值對反硝化細菌降解氨氮、亞硝態氮性能的影響

36 h內不同pH值對反硝化細細菌去除亞硝態氮效果的影響情況見圖 2。在36 h 后 pH 值在 6．5，7．5，8．5時的降解率，分別達到了 82．78%，94．65%，76．76%。pH值為7．5時降解率有最高值94．65%，pH值為6．5時的降解率與pH值為8．5時差異性不顯著。pH值為5．5和9．5時對亞硝態氮的清除能力分別為45．89%，59．67%，明顯比不上其他3種pH值下的降解率。綜上可知，在pH值約為7．5時反硝化細菌對亞硝態氮的清除能力最強。

36 h內不同pH值對反硝化細菌去除氨氮效果的影響情況見圖 3。在經過 36 h 后，pH 值在 6．5，7．5，8．5時的降解率，分別達到了 76．29%，83．25%，66．83%。而pH值在5．5，9．5時的降解率僅有36．64%，56．43%，明顯遜色于其他3種pH值下的降解率，且pH值在6．5時的降解率與在7．5時的降解率差異不顯著。所以，反硝化細菌對氨氮降解的最適pH值約為 7．5。

對比圖2圖3，反硝化細菌對亞硝態氮的清除能力比銨態氮強。pH值約在7．5時，對兩者的清除能力均較強。

2．3 溫度對反硝化細菌去除氨氮、亞硝態氮性能的影響

36 h內不同溫度對反硝化細菌去除亞硝態氮效果的影響情況見圖4。在不同的溫度條件下，隨著時間的增長，反硝化細菌對亞硝態氮的降解率逐漸增大，且在36 h時30℃條件下的清除率達到了94．63%，35℃條件下的降解率達到了97．68%，兩者的降解效率比較接近，且都處于較高水平。在40，25，20℃時的降解率分別為81．43%，80．58%，67．34%。可以看出，在30，35℃的降解率差異不顯著，且均處于較高水平，可知30～35℃的溫度范圍是反硝化細菌降解亞硝態氮的最適范圍。

36 h內不同溫度對反硝化細菌去除氨氮效果的影響情況見圖5。經過36 h后，溫度為35℃時有最高降解率85．32%，30℃時的降解率達到了78．54%，僅次于35℃時的降解率;而在溫度為20，25，40℃下的降解率僅為45．34%，63．45%，56．12%，從而可以看出，溫度在30～35℃時反硝化細菌對氨氮的清除能力較強。

對比圖4圖5，反硝化細菌對亞硝態氮的清除能力比氨氮強。溫度在30～35℃間，對兩者的清除能力均較強。

圖3 pH值對反硝化細菌降解氨氮的影響

圖4 溫度對反硝化細菌降解亞硝態氮的影響

圖5 溫度對反硝化細菌降解氨氮的影響

2．4 C/N對反硝化細菌去除氨氮、亞硝態氮性能的影響

36 h內不同C/N下反硝化細菌對亞硝態氮的降解性能見圖6。在起始階段，不同C/N下的降解率均較低，12 h后對于降解率開始逐漸增強，且在36 h時，C/N為7時的降解率達到了最高值94．34%;降解率處于第二位的是在C/N為5時的降解率，達到了73．78%，兩者之間的差異性顯著;其他3種C/N下的降解率比C/N為5時的降解率還要低，故在C/N為7時反硝化細菌對亞硝態氮有較高的降解率。

36 h內不同C/N下反硝化細菌對氨氮的降解性能見圖7。隨著時間的延長，反硝化細菌在不同C/N下的降解率均逐漸增強，且C/N為7時的降解率一直處于優勢狀態。在36 h時，C/N為7時的降解率達到了最高值73．45%，相對于其他4種C/N比有明顯優勢。所以，在C/N為7時反硝化細菌對于氨氮具有較高的降解率。

對比圖6圖7，在C/N為7時，反硝化細菌對氨氮、亞硝態氮的降解率均較高，且隨時間的延長降解率升高。

圖6 C/N對反硝化細菌降解亞硝態氮的影響

圖7 C/N對反硝化細菌降解氨氮的影響

3 結論與討論

本次研究結果表明，對反硝化細菌降解亞硝態氮、氨氮的最適pH值約為7．5，而一般認為在中性偏堿性條件下適合微生物進行反硝化作用［10］。當pH值超出這個范圍時，會影響反硝化細菌的生長速率和反硝化酶的活性，使脫氮效率有所下降。王敏［11］認為，硝酸菌生長的最佳pH值為7．4～8．3。陳徉［12］認為，反硝化微生物生長的最適宜pH值為7．0～8．5，當pH值大于8．5或小于6．0時，將會較大地影響海水反硝化細菌的處理效果，使反硝化速率大大降低。

趙昕［7］認為，海水反硝化細菌的適應范圍比較廣，在25～40℃的范圍內都有較好的降解效果，而本次研究獲得的反硝化細菌在溫度為30～35℃的范圍內對亞硝態氮的降解率達到了94%以上，對氨氮的降解率達到了78%以上，因此還是需要較高水溫的。

不同的碳源種類是通過影響硝酸還原酶以外的其他酶來影響反硝化作用過程的。C/N對反硝化作用的影響受培養方式、溫度、所用碳源等多種因素的影響［13］。本次研究所選擇的反硝化細菌適合的C/N為7。

本次研究獲得的反硝化細菌有待進一步進行生物學鑒定。

利用微生物來降解養殖水體中的有害銨態氮、亞硝態氮是未來生態養殖的一個趨勢，相信伴隨著國民對食品安全性的重視，微生物制劑在水產養殖上有更廣闊的應用前景。

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