siRNA抑制α乙酰輔酶A羧化酶基因表達促進前列腺癌干細胞凋亡＊

楊 波，趙德明，劉 輝，劉 峰，郝繼東，王偉峰，萬建省（.上海市浦東新區周浦醫院 038；.上海市第七人民醫院 038）

目前的研究證實，前列腺癌起源于前列腺癌干細胞，前列腺癌干細胞在前列腺癌的發生、發展過程中具有至關重要的作用［1－3］。聯合應用傳統腫瘤放化療和腫瘤干細胞靶向治療藥物將可能從根本上治愈腫瘤，因此腫瘤干細胞將成為人類癌癥治療的新靶標［4］。小干擾RNA（siRNA）通過向細胞內導入長度為21～23的核苷酸序列，高度特異性地降解同源mRNA序列，從而有效地阻止相應蛋白質的表達［5－6］。本研究將采用這一技術對前列腺癌干細胞進行干預，并且以此為基礎來發現藥物的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 標本來源 前列腺癌干細胞由本實驗室從DU145細胞株中篩選來，大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，PsilencerTM4.1－CMV neo真核表達載體購自Ambion公司，質粒抽提純化試劑盒和T4DNA連接酶購自Takara公司，真核轉染試劑lipofectamineTM2000和Trizol購自Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自MBI公司，G418購自美國Alexis公司，ACC－α二抗購自碧云天生物技術公司。Hoechst 33342染料購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的合成 使用設計工具軟件（參見www.ambion.com／techlib／misc／siRNAfinder.html），依據試劑盒（美國Ambion公司）所提供步驟合成。α乙酰輔酶A羧化酶（ACC－α）siRNA序列為：CAAUGGCAUUGCAGCAGUGdTdT，反義序列：C ACUGCUGC AAUGC－C AUUGdTdT。

1.2.2 特異的siRNA表達載體的構建及序列測定 取PsilencerTM4.1－CMV neo與退火后的雙鏈siRNA模板混合，在T4DNA連接酶的作用下，22℃1h，65℃10min，形成重組質粒。將重組質粒和Ambion公司試劑盒提供的陽性對照質粒和陰性對照轉染至感受態細胞DH5α。感受態細菌制備和轉化參照文獻。挑取陽性克隆擴增培養后，抽提并純化質粒，由上海生工生物工程公司測序并鑒定陽性克隆。

1.2.3 細胞培養及轉染 前列腺癌干細胞用含10%小牛血清的DMEM培養液于37℃、5%CO2培養箱內培養。轉染前1d胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度達到90%。轉染步驟按LlipofectamineTM2000說明書進行，約6～8 μg的 ACC－αsiRNA 質粒、P75 2－siRNA 質粒、P75 3－siRNA 質粒，分別用15μL LipofectamineTM2000轉染至SKBR3細胞，空白對照以雙蒸水替代質粒。

1.2.4 Western blot檢測 ACC－α表達 分為空白對照組、ACC－α－siRNA轉染組，分別于處理24、72、96h后提取蛋白，定量并進行SDS－PAGE電泳，120伏電泳90min，然后200mA 2 h電轉印于PVDF膜上。用封閉液（1×TBST，5%脫脂奶粉）室溫振搖封閉2h，洗膜。加入免抗人P75一抗（1∶200），室溫孵育2h，洗膜，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育1.5h，洗膜。最后用ECL化學發光試劑盒檢測雜交信號，在Bio－Rad凝膠儀上成像。

1.2.5 細胞增殖作用的影響 實驗分兩組：空白對照組，siRNA轉染組。按2×104／mL接種于96孔板，細胞貼壁后更換無血清DMEM培養液，37℃、5%CO2中培養6h，細胞同步化后用含10%小牛血清的DMEM 培養液100μL（含100 ng／μL NGF）［3］，繼續培養24、48、72h，然后每孔加20μL MTT繼續培養4h，棄培養液，加入二甲亞砜（DMSO）100 μL，振蕩使結晶完全溶解，30min后用酶標儀檢測490nm處的吸光度值［A（490）］，每組平均5個復孔，重復3次。

1.2.6 熒光染色觀察 轉染96h后在細胞培養液中加入Hoechst 33342染料，培養2h后使用熒光顯微鏡觀察細胞核的形態變化。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western Blot檢測siRNA轉染效果 細胞系轉染siRNA后的24、72h和96h后提取細胞總蛋白經Western blot檢測發現，ACC－α的表達在轉染后的96h明顯下調，說明siRNA轉染成功抑制了ACC－α的表達。

圖1 Western Blot檢測結果

2.2 細胞增殖檢測 使用MTT染色檢測siRNA干擾ACC－α表達對細胞增殖和存活率的影響。結果發現，空白對照組細胞增殖狀態良好；在轉染后72h時，轉染組的活細胞數目開始低于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），在轉染96h后，轉染組的活細胞數目開始大幅度降低，與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 細胞增殖MTT檢測結果

圖3 細胞凋亡檢測

2.3 熒光染色檢測細胞凋亡 經熒光染色發現，ACC－αsiRNA轉染組的細胞存在明顯的核碎裂和染色質凝聚，這是細胞凋亡的典型標志，見圖3A。在空白對照組內只發現較低水平的細胞凋亡現象，見圖3B。

3 討 論

目前在很多腫瘤中都發現了脂類合成酶表達的增強。脂肪合成酶（FAS）是一類重要的脂類合成酶在長鏈脂肪酸的生物合成中起重要的催化作用，現已證明其在腫瘤早期的發生中起重要作用［7－8］。在許多癌癥中，FAS也參與腫瘤后期的發生和發展。研究發現在前列腺癌中，ACC－α也具有同樣的作用，ACC－α是脂肪合成過程中的限制酶，主要催化乙酰輔酶A和CO2反應生成丙二酰輔酶A［9］。

眾多研究都發現，在所有良性成體瘤組織中脂類合成的水平都非常低，然而在惡性腫瘤中脂類合成水平卻非常高。這提示腫瘤細胞內源性脂類物質的合成或許可以作為癌癥治療的潛在靶點［10］。迄今為止，所有的相關研究都圍繞FAS展開，化學FAS抑制劑和特異性更高的生物學方法，如FAS siRNA干擾等都具有抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡的效果［11］。在本研究中針對脂類合成過程中的ACC－α進行研究，發現通過siRNA干擾手段抑制ACC－α的表達后也對前列腺癌干細胞起到了較好的抑制作用。研究中還發現ACC－αsiRNA干擾與目前廣泛報道的FAS siRNA干擾所起到的效果基本類似，這提示ACC－α基因可能會成為前列腺癌治療的新型靶點。

在腫瘤細胞中抑制脂肪生成和可能會導致腫瘤細胞死亡，但其具體機制有待進一步調查。本研究中抑制脂類合成后癌癥干細胞出現凋亡，增生減少可能的解釋如下。惡性腫瘤細胞的基本特征之一是不受控制的細胞增殖。細胞增殖的過程中需要合成大量的細胞膜，而脂類是合成細胞膜所需的重要成分。腫瘤細胞大量合成脂類物質或許就是用于增殖。細胞分裂的G1期是合成細胞膜的階段，通過siRNA干擾，抑制脂類的合成，使腫瘤細胞無法形成細胞膜，擾亂器細胞周期，從而也就相應的抑制了腫瘤細胞分裂和增殖［12］。此外，細胞膜上還分布眾多蛋白質，比如受體，這些分子在細胞信號轉導中起關鍵作用。細胞膜合成受阻，腫瘤細胞生存和分裂相關的生理生化過程將受到抑制［13］。這可能是ACC－αsiRNA抑制腫瘤細胞分裂增殖的潛在機制。

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