羧基磁珠吸附乙型肝炎病毒表面抗原的性能研究＊

林梅雙，吳曉蔓（廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州 510260）

磁珠被廣泛應用于蛋白質的分離提純、細胞分離、酶的固定、免疫分析等多個領域［1－4］。以磁珠為固相介質對蛋白質進行提純是一項新興的蛋白質分離技術，與傳統分離方法比較，蛋白質的磁分離技術具有快速、高純、高收率等優點［5］。羧基磁珠是表面帶有羧基功能團的磁珠，其吸附蛋白是基于磁珠表面的陰離子交換基團－COOH與表面帶正電的蛋白之間的作用［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）分子量大，其結構變化對活性影響較大，結構和活性表征相對容易研究且手段多［7］，所以本文選擇HBsAg作模型蛋白質。研究使用市場上廣泛生產的表面帶有羧基的聚合物磁珠吸附HBsAg的性能，為磁珠在蛋白質分離純化中的應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 血源性HBsAg純品由上海葉民生物技術有限公司提供。

1.2 儀器與試劑 羧基磁珠與磁分離架分別由上海奧潤微納新材料科技有限公司和無錫中德伯爾生物技術有限公司提供，HBsAg酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒和BCA蛋白質定量試劑由沈陽惠明生物工程有限公司和天根生化科技有限公司提供，瑞士TECAN酶標儀Infinite M200，以上試劑均在有效期內使用，嚴格按說明書操作。

1.3 方法

1.3.1 影響磁珠吸附HBsAg的因素 取1mL血源性HB－sAg純品，加入200μL 5mg／mL的磁珠和18μL 1mmol／L氯化鋅，混勻后，在37℃溫箱中放置5min，通過磁場分離磁珠，吸出液體為吸附后溶液。改變磁珠用量、HBsAg原始濃度、吸附溫度、吸附時間。BCA法測定吸附前、吸附后HBsAg的蛋白含量，計算吸附量。判斷影響磁珠吸附HBsAg的因素。

1.3.2 HBsAg的洗脫 取某一濃度的血源性HBsAg純品，按上述方法進行磁珠吸附后，用10mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 5.0 3次清洗磁珠，加入250μL 10mmol／L 的NaOH溶液，洗脫1min后，通過磁場分離磁珠，吸出液體為洗脫液。BCA法測定吸附前、吸附后和洗脫液的HBsAg蛋白含量，計算洗脫率。將洗脫液稀釋10萬倍后，ELISA測定洗脫液的稀釋液和不同濃度（2、5、10、15、20、25、30ng／mL）HBsAg標準品溶液HBsAg的吸光度（A）。通過標準品濃度－A值標準曲線，計算洗脫液HBsAg的生物活性濃度占BCA法檢測的洗脫液HBsAg濃度的百分比，即為洗脫液中HBsAg的生物活性保留率。

1.3.3 判斷吸附量與洗脫率 按以下公式計算：

Q＝（C0V0－C1V1）／m

洗脫率（%）＝C2V2／（C0V0－C1V1）×100%

式中：Q 為吸附量（μg／mg）；m 為磁珠的質量（mg）；C0、C1、C2分別為吸附前、吸附后和洗脫液的 HBsAg濃度（μg／mL）；V0、V1、V2分別為吸附前、吸附后和洗脫液的體積（mL）。

2 結 果

2.1 磁珠用量 隨著磁珠用量的增加，吸附的總蛋白逐漸增多，但單位磁珠的吸附量卻減少。見圖1、2。

圖1 磁珠用量對吸附HBsAg總量的影響

圖2 磁珠用量對HBsAg吸附率的影響

2.2 HBsAg濃度 磁珠吸附HBsAg的量隨HBsAg初始濃度的增加而增多，在較低濃度范圍（小于200μg／mL）時，吸附量隨HBsAg濃度的增加而增多趨勢比較明顯；而在較高的濃度范圍（大于200μg／mL），趨勢變緩。見圖3。

圖3 HBsAg濃度對HBsAg吸附率的影響

圖4 溫度對吸附HBsAg的影響

2.3 溫度 隨著溫度增高，磁珠吸附HBsAg的能力也增強。見圖4。

2.4 吸附時間 磁珠吸附在5min時達到峰值，但隨著時間延長能力有所降低，大約在30min時進入平臺期。見圖5。

2.5 HBsAg的洗脫 磁珠吸附濃度為524.24μg／mL的血源性HBsAg純品后，使用10mmol／L NaOH溶液洗脫HBsAg，洗脫率是71.02%，活性保留率為88.15%。

圖5 吸附時間對吸附HBsAg的影響

3 討 論

相對傳統分離方法，蛋白質的磁分離技術有更多的優勢。而表面帶有－COOH功能基團在蛋白質分離提純中比較常用。

本研究通過磁珠用量、HBsAg濃度、溫度、吸附時間各方面來探討市場上廣泛生產的帶有羧基的聚合物磁珠吸附HB－sAg的性能。結果顯示：（1）隨著磁珠用量的增加，吸附 HB－sAg的總蛋白量逐漸增多，但單位磁珠的吸附量卻減少。磁珠用量的增加使有限空間內磁珠的總表面積增大，從而促進了吸附反應進行，但同時也大大降低了單個磁珠與HBsAg碰撞的機會，導致單個磁珠吸附 HBsAg的量降低。（2）磁珠吸附HBsAg的量隨HBsAg初始濃度的增加而增多，在較低濃度范圍時，吸附量隨HBsAg濃度的增加而增多趨勢比較明顯；而在較高的濃度范圍，吸附量隨HBsAg初始濃度的增加而增多的趨勢變緩。隨著HBsAg濃度的增加，磁珠表面所吸附的HBsAg分子也逐漸增加，直至達到飽和狀態，此時雖然再增加HBsAg的初始濃度，但受磁珠表面積的限制，HBsAg的吸附量也不會發生太大的變化。（3）隨著溫度增高，磁珠吸附HB－sAg的能力也增強。可能是溫度會影響HBsAg分子的布朗運動，導致HBsAg與磁珠碰撞吸附行為的變化，低溫（4℃）時，HBsAg吸附率略低，隨溫度升高，HBsAg吸附率逐漸增大。也可能是在pH接近中性的溶液中，磁珠吸附HBsAg的主要驅動力是疏水作用，通常情況下，在一定溫度范圍內疏水作用力會隨溫度升高而增強，導致磁珠吸附HBsAg增強。（4）磁珠吸附在5min時達到峰值，但隨著時間延長能力有所降低，大約在30min時進入平臺期。可見磁珠在較短時間內吸附HBsAg達到飽和，但是隨著時間延長又慢慢解離，直到進入平衡狀態。以上實驗結果表明羧基磁珠能夠吸附HBsAg，但不穩定，易受磁珠用量、HBsAg濃度、溫度、吸附時間等多因素影響，在實驗過程中要嚴格控制實驗條件。

使用10mmol／L NaOH溶液洗脫 HBsAg的洗脫率是71.02%，活性保留率為88.15%。在一定pH條件下，羧基磁珠帶負電會與帶正電的基團在二價離子的作用下，發生共價結合，改變pH值會使結合上去的物質釋放下來，因此被吸附在磁珠上的HBsAg可以通過NaOH溶液洗脫下來。實驗證實磁珠吸附上的HBsAg不但可以洗脫下來，而且洗脫下來的HBsAg仍具有較好的抗原活性。在實驗中發現，如果沒有加入二價離子磁珠是無法吸附蛋白質的。至于為何要加入二價離子，有學者認為磁珠與二價金屬溶液充分接觸后，形成表面螯合二價離子的磁性金屬親和載體，可選擇性吸附含組氨酸殘基的蛋白質［8］。本次研究運用市場上廣泛生產的帶有羧基的磁珠吸附血源性純HBsAg，探討磁珠吸附HB－sAg的性能，確定磁珠吸附蛋白質的機制，為磁珠吸附其他蛋白質奠定基礎。

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