乳腺癌外周血標記物FAM83A的檢測及臨床意義*

許亞娜， 許 倩， 劉 鐳

(1.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000 2.承德醫學院基礎醫學研究所， 河北 承德 067000 3.承德醫學院免疫學教研室， 河北 承德 067000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，治療失敗的主要原因是具有轉移潛能的腫瘤細胞在術前或術中脫離原發灶隨血行轉移。還有學者提出微轉移是一個獨立的預后指標，其價值優于腫瘤的分級和分期。因此，及時發現腫瘤的血行微轉移，對減少日后轉移性腫瘤的發生、改善預后、提高生存率，具有重要的意義。FAM83A是一種新鑒定的腫瘤特異性抗原［1］，研究發現其在肺癌患者外周血中高表達，對肺癌的預后和治療評價具有指導意義［2］。本文通過腫瘤基因組解剖計劃(CGAP)SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)數據庫發現FAM83A基因在乳腺癌外周血中也高表達。以該基因作為分子標記物，測定了乳腺癌患者外周血的微轉移情況，并進一步分析該基因與乳腺癌發生和轉移的關系。

1 材料和方法

1.1 材料:收集2009年11月至2012年8月在承德醫學院附屬醫院腫瘤科病歷資料完整的乳腺癌外周血標本84例，均為女性，年齡21－82歲，中位年齡52歲。

抽血前均未接受化學治療和放射治療。所有患者均經手術治療證實，手術后均經病理確診。其中59例浸潤性導管癌，4例單純癌，3例濕疹樣癌，11例髓樣癌，7例浸潤性小葉癌。淋巴結轉移陽性53例，淋巴結轉移陰性31例。Ⅰ和Ⅱ期乳腺癌患者56例，Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者28例。雌激素受體(ER)陽性51例，陰性33例。孕激素受體(PR)陽性39例，陰性45例。HER2陽性43例，陰性41例。正常捐獻者外周血60例，均為女性，年齡22－76歲，中位年齡為49歲，與乳腺癌組比較無統計學差異。經胸片和B超檢查未發現乳腺相關和其它疾病。

1.2 差異基因的篩選:利用CGAP提供的SAGE Genie數據庫(http://cgap.nci.nih.gov/SAGE)，選取數字基因表達演示(DGED)工具。選擇乳腺癌組織和正常白細胞兩個池，設置F值為16，即表達差異大于16倍以上，P值設置為0.01。差異表達的基因按差異顯著性高低排序，比對出在短序列標簽文庫和長序列標簽文庫中都出現的差異基因，作為候選基因。

1.3 總RNA提取和cDNA合成:將3－5mL外周血置于淋巴細胞分離液上，密度梯度離心法分離單個核淋巴細胞。細胞計數后，按106個細胞/mL在1.5 mL eppendorf管中加入適量TRIzol試劑，提取總RNA。分光光度法測定純度后取5μg，按逆轉錄試劑盒(QIAGEN)操作步驟進行逆轉錄獲得cDNA。

1.4 實時半定量巢式PCR方法檢測外周血癌細胞:第一輪PCR反應體系包括:2.5μL外周血的cDNA模板，0.2μmol/L 外側引物(上游序列為:5’CACTTCTTGGAGGTGCCCTGCACG 3’;下游序列為:5’TAGAGGCAGCCAACAAGCGTG 3’)，0.2 mM dNTP，50 mM Tris－HCl(pH 8.3)，10 mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2 mM MgCl2，0.75 U of Taq polymerase ，總體積為25μL。反應條件為:94℃變性 20s，62℃30s，72℃延伸 80s，35個循環后，再72℃延伸10min。

取2μL第一輪PCR的產物作為第二輪的模板，20μL PCR反應體系還包括:0.25μmoL/L內側引物(上游序列為:5’CACTTTGGTTCCTGATGGCTT 3’;下游序列為:5’CTCCCAAGCCCAGCTTTCCAAAGG 3’)，SYBR Green PCR master mix(上海基康生物技術有限公司)。反應條件:94℃變性4min，然后94℃15s，60℃30s，再72℃40s，共40個循環擴增。GAPDH 為內參照，每個樣本的每個待測項目均測3次，取平均值。記錄各樣品的Ct值，并計算各組目的基因的相對表達量。計算公式為:△CtFAM83A=CtFAM83A－CtGAPDH;△△Ct=△Ct腫瘤－△Ct正常人平均值;目的基因的相對量 Q為:2－ΔΔCt。將特異性為100%時的－△Ct值作為界限值。

1.5 統計學處理:采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析。乳腺癌病例對照的比較采用t檢驗，病例按臨床病理特征分組后不同組的比較采用方差分析。

2 結果

表1 乳腺癌外周血FAM83A表達水平與臨床病理特征的關系(mean±SD)

2.1 乳腺癌外周血高表達基因FAM83A的鑒定:在 SAGE文庫中，比對出在10bp的短標簽文庫(short tags)和17bp的長標簽文庫(long tags)中共同出現的基因，最終篩選出22個在乳腺癌中高表達的基因。其中FAM83A高度差異表達，并經RT－PCR驗證其在10乳腺癌外周血標本中有5例表達，而10例正常人外周血中無1例表達，可作為外周血檢測乳腺癌的標記物。

2.2 乳腺癌外周血FAM83A的表達水平:實時半定量巢式PCR檢測外周血FAM83A mRNA表達水平，測得乳腺癌組患者－△Ct為 3.84±2.2，顯著高于正常組－△Ct(－8.11±2.5)，P＜0.001，見圖 1。乳腺癌患者FAM83A mRNA 相對表達量為:53.24±22.7。根據界限值，得到FAM83A在乳腺癌中的陽性表達率為40.5%(34/84)。

2.3 FAM83A表達與臨床病理特征的關系:外周血腫瘤標記物FAM83A表達與臨床分期(P＜0.001)、淋巴結是否轉移(P=0.001)和 ER(P=0.001)、PR(P=0.038)、HER2(P=0.001)相關。而與年齡(P=0.338)、病理類型(P=0.898)和腫瘤大小(P=0.056)無相關性。詳見表1。

圖1 FAM83A在乳腺癌和正常組外周血中的表達比較

3 討論

大部分乳腺癌患者均經歷手術為主的綜合治療，但許多病例甚至相當部分早期患者仍出現腫瘤的復發和轉移。具有轉移潛能的腫瘤細胞在術前或術中已脫離原發灶，以非常少的數量轉移到淋巴結、骨髓、血液或遠處器官中，普通的檢測手段卻不能發現，稱為“腫瘤微轉移”［3］。通過檢測血液循環中癌細胞，可發現最低限度殘留病灶，提高腫瘤分期的準確性，對腫瘤的轉移與否和預后判斷有重要意義，而且還可了解綜合治療療效，指導進一步治療。及時發現腫瘤的血行播散并給予有效治療，將有助于殺滅血中播散的腫瘤細胞，減少日后轉移性腫瘤的發生，改善預后，提高生存率［4］。但由于播散到外周血中的實體腫瘤細胞數目非常少，需要高度敏感、特異的技術對其進行檢測。RT－PCR檢測特異性標志蛋白mRNA的表達已被證明是檢查外周血、淋巴結和骨髓中循環癌細胞和檢測隱匿性癌轉移的高度敏感方法。其基礎是轉移的惡性腫瘤細胞仍然表達具有起源組織特征的特異標記，主要用于檢測實體腫瘤的微轉移。如果采用巢式PCR技術則敏感性更高，10mL全血中有10個癌細胞就能被檢測出，而常規PCR技術10mL全血中含1000個以上癌細胞時才可檢測出［5］。本實驗，我們采用了熒光半定量巢式PCR方法，第一輪為普通PCR反應，結束后取擴增產物2μL作為模板加入到第二輪體系中，而第二輪PCR檢測則采用熒光定量技術，對擴增產物進行相對的定量檢測。這樣既保證了檢測的敏感性，又兼具有real－time PCR定量的優勢。

有效的微轉移的檢測，僅僅敏感的方法還不夠，還需要特異性好的標志物基因。由于目前在實體瘤中尚無特異明確的腫瘤標記物，因此，主要采用組織特異mRNA轉錄物為標記物。生物信息學是綜合計算機科學、信息技術和數學的理論和方法來研究生物信息的交叉學科。利用現有的分析工具和各種公共數據庫，提供一條快速發現和研究新基因的新途徑。而基因表達系列分析(SAGE)是通過快速和詳細分析成千上萬個EST(express sequenced tags)來尋找出表達豐富度不同的SAGE標簽序列，發現新的未知的序列。CGAP SAGE計劃建立了SAGE數據庫網站(http://cgap.nci.nih.gov/SAGE)，可以分析代表某條基因名稱的SAGE標簽表達水平。隨著“腫瘤基因組解剖工程”的進行，CGAP SAGE可以通過網站分析和展示SAGE數據，并自動的將基因名稱和SAGE轉錄物水平聯系起來。因此，SAGE技術對于全面分析腫瘤組織基因表達譜、尋找腫瘤特異性表達新基因、發現腫瘤組織特異標志物和揭示腫瘤發病的分子機制發揮重要的作用［6］。本試驗中，為了尋找檢測乳腺癌外周血循環癌細胞的腫瘤標記物，我們在SAGE文庫中選擇了乳腺癌組織和正常白細胞兩個池。最終篩選出23個短序列標簽和長序列標簽所共同代表的差異基因，然后用RT－PCR方法，對這些基因進行驗證。選取10例乳腺癌和10例正常人外周血標本，理想的腫瘤標記物要求在10例乳腺癌標本中至少有兩例表達，而在10例正常人標本中≤2例表達。研究結果顯示在篩選過程中，主要出現以下兩種情況:①有的腫瘤基因雖然在組織中高表達，但在外周血中檢測陽性率非常低;②有的腫瘤基因雖然在乳腺癌外周血單個核細胞上高表達，但其在正常人外周血單個核細胞上的表達也很高，因此不能作為診斷的標記物。最后，我們得到了一個在乳腺癌外周血中高表達的新的腫瘤標記物基因NPY1R。本文中的結果也進一步證實了生物信息學分析的可靠性。

FAM83A是最新發現的腫瘤特異性抗原，在肺癌、乳腺癌和結腸癌中呈高表達，而在正常組織中均不表達。有文獻［1］報道其在肺癌的外周血中大約有34%的檢出率，而本研究發現，其在乳腺癌外周血中陽性檢出率高達40.5%(34/84)。并且，與臨床分期，淋巴結轉移以及ER、PR和HER2的水平相關，提示該腫瘤標記物可用于輔助臨床分期，預測轉移的發生和指導乳腺癌的治療。但是，有關該基因與乳腺癌的發病機制目前尚無報導，有待我們進一步研究。

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［2］L Liu，GQ Liao，P He，H Zhu，et al.Detection of circulating cancer cells in lung cancer patients with a panel of marker genes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，372(4):756－760.

［3］Goldhirsch A，Glick J H，Gelber，et al.Meeting Highlights:International consensus panel on the treatment of primary breast cancer.Seventh International Conference on Adjuvant Therapy of Primary Breast Cancer［J］.Clin Oncol，2001，19(18):3817－3827.

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［6］Ersen Kavak，Mustafa nlü，Monica Nistér，et al.Meta－analysis of cancer gene expression signatures reveals new cancer genes，SAGE tags and tumor associated regions of co－regulation［J］.Nucleic Acids Res，2010，38:7008－7021.