格列衛誘導癌蛋白半乳凝集素-3通過溶酶體降解并促進膠質母細胞瘤U87細胞的凋亡

李曉明，陶英群，朱廷準，梁國標

半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)具有識別并結合β-半乳糖苷的特性，因為參與調節腫瘤細胞的粘附、增殖、轉化、轉移及血管生成等過程，與腫瘤的惡性程度相關［1］，也被稱為腫瘤相關蛋白［2］。在不同的腫瘤組織中，Gal-3呈現不同的上調表達，目前，在諸多的癌癥如甲狀腺腫瘤和乳腺癌、胃腸癌、卵巢癌、淋巴瘤、肺癌及黑色素瘤的患者血清中，已經成為診斷和判斷預后的生物指標［3］。已有研究表明，用免疫組化染色和定量染色評分的方法發現，Gal-3在膠質母細胞瘤(Ⅳ級膠質瘤)組織中大量表達［4］，而在低級(Ⅱ級)膠質瘤組織中基本不表達，在間變型(Ⅲ級)膠質瘤組織中處于中間表達，正常腦組織和良性腫瘤中不表達Gal-3蛋白，說明Gal-3的表達與膠質瘤的惡性程度成正相關性［5］。近年來，Gal-3因已成為抗癌藥物的靶點而備受關注，已有多種Gal-3抑制劑開發出來作為抗癌藥物的先導分子［6］。因此，研究格列衛在腫瘤細胞中的作用機制和與細胞凋亡的關系有重要的理論意義和應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 格列衛(Gleevec，酪氨酸激酶抑制劑)為諾華制藥有限公司產品;STS(Stauroporine，星形孢菌素-凋亡誘導劑)和溶酶體抑制劑ConA、核染料 Hochest33342、細胞分離液 percoll均為Sigma公司產品;膠質母細胞瘤細胞株U87由本實驗室凍存;DMEM培養基為invitrogen公司產品;胎牛血清購自四季青公司;Gal-3鼠單克隆抗體和Lamp2兔多抗均為Santa Cruz Biotechnology產品，β-actin鼠單克隆抗體為Sigma公司產品;山羊抗鼠FITC熒光二抗和山羊抗兔TRITC熒光二抗為中山公司抗體。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U87細胞株用含10%胎牛血清的 DMEM培養基(含100 IU/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素)培養，置 37 ℃、5%CO2、濕度95%的恒溫培養箱中培養并傳代。

1.2.2 細胞免疫染色 先用3.7%多聚甲醛溶液固定細胞，室溫孵育15 min，用PBS洗3次，每次5 min。0.1% 的 TritonX-100，室溫孵育 5 min后PBS洗3次;然后用1%山羊血清封閉1 h，PBS洗3次;1%山羊血清封閉液配制的一抗孵育1 h后用PBS洗3次;二抗孵育1 h后PBS洗3次;最后用1 μg/mL Hochest33342進行細胞核染色，室溫孵育30 min后用PBS洗3次，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 溶酶體提取 所有操作都在4℃進行。用 STE緩沖液［0.25 M 蔗糖，20 mM Tris/HCl(pH 7.2)，5 mM MgCl2］與細胞孵育 20 min，在顯微鏡下觀察細胞膨脹率達90%以上，用Dounce勻漿器將收集的細胞進行勻漿，勻漿后在鏡下觀察細胞90%以上破碎時，在800 g離心10 min，此時收集的上清稱為 PNS(Postnuclear supernatant)。將PNS小心注入裝有23%(v/v)percoll離心管中，高速離心，59 000 g離心27 min，可得到分離的溶酶體。

1.2.4 Western blot檢測蛋白量 將“1.2.3”步驟中分離得到的溶酶體或者各處理組細胞在不同時間點收取細胞后，分別加入單去污細胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02% 疊氮鈉，1%NP40，復合蛋白酶抑制劑)，裂解物加入5×SDS上樣緩沖液在沸水中煮沸5 min，裂解上清經10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜濕轉300 mA 60 min，分別與抗 Gal-3抗體和抗 β-actin抗體、抗Lamp2蛋白進行孵育，再與辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育，最后用化學發光試劑顯影，凝膠系統成像，Gal-Pro analyzer軟件分析條帶灰度值，以 Gal-3/β-actin和 Gal-3/Lamp2蛋白表達的條帶灰度比值作為Gal-3蛋白的相對表達量。

1.2.5 Sub G1方法檢測細胞凋亡率 將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含血清的培養基終止反應，500 g離心3 min，再用PBS洗細胞，再次離心沉淀細胞。逐滴加入2 mL的70%乙醇(70%乙醇溶于PBS中)，在冰上孵育30 min，重復用PBS洗2次后離心沉淀，加2 mL P-C Buffer(0.2 M NaH2PO4192 mL;0.2 M檸檬酸鈉8 mL)，室溫孵育30 min。用PBS洗2次后離心沉淀，加入0.3 mL RNase溶液(20 μg/mL，PBS 溶解)，孵育 30 min 后加 3 μL pI溶液(10 mg/mL，PBS溶解)，孵育5 min。用流式細胞儀檢測，分析凋亡細胞比率。

2 結果

2.1 格列衛誘導Gal-3進入溶酶體 用5 μM格列衛處理 U87細胞 18 h，對照組 U87細胞用0.1%DMSO(0.1%DMSO是溶解格列衛時的助溶劑)處理相同時間，一抗分別用抗Gal-3抗體、抗Lamp2抗體(溶酶體膜蛋白標記物)，熒光二抗分別用FITC標記Gal-3、TRITC標記Lamp-2進行細胞免疫染色，用Hochest33342標記細胞核，如圖1所示，未經處理的U87細胞中，Gal-3主要分布在細胞核，細胞質中也有少量分布，Lamp-2呈現點狀分布;用格列衛處理后，Gal-3發生點狀聚集并與溶酶體蛋白Lamp-2呈共定位(Merge圖中的黃色區域)，說明Gal-3聚集到了溶酶體。

圖1 格列衛處理U87細胞株免疫染色結果

為了進一步證明格列衛能夠使Gal-3聚集到溶酶體，將U87細胞分成2組，一組使用5 μM 格列衛處理18 h，另一組用0.1%DMSO處理，然后對兩組細胞按照溶酶體的提取方法提取溶酶體并進行Western blot檢測，如圖2所示。以Lamp-2表達量為內參，在沒有細胞質污染的情況下，對兩組細胞的溶酶體Gal-3/Lamp-2蛋白表達條帶灰度值的比值進行比較，格列衛處理組細胞的溶酶體中Gal-3的量是非處理組的6.91倍，說明格列衛誘導Gal-3聚集到溶酶體中。

圖2 格列衛處理后U87細胞株溶酶體中Gal-3量的變化

2.2 格列衛使U87細胞中Gal-3蛋白量下降 以β-actin作為內參，對各不同處理組 Gal-3/β-actin蛋白表達條帶灰度比值進行比較，如圖3所示。用5 μM 格列衛處理U87細胞18 h后，檢測細胞內源Gal-3的蛋白量，發現與未處理組細胞相比，Gal-3的蛋白量降低至48.73%，單獨使用0.5 μM凋亡誘導劑STS處理時，Gal-3的蛋白量沒有顯著變化;當5 μM 格列衛和0.5 μM STS同時處理細胞時，Gal-3蛋白量降低至17.88%，說明格列衛和STS同時使用，在促Gal-3蛋白降解方面起到協同的作用;當在上述的各組處理中加入溶酶體特異性抑制劑ConA(10 μM)后，格列衛處理組與未處理組細胞中Gal-3的蛋白量沒有顯著差異，說明Gal-3通過溶酶體途徑發生了蛋白的降解。

圖3 格列衛對Gal-3蛋白量的影響

2.3 格列衛促進U87細胞凋亡 將U87細胞分成格列衛(5 μM)處理和不處理2組，處理18 h后，將兩組細胞再分成用STS(0.5 μM)處理和不處理2組，處理12 h后，每組設3個重復，用流式細胞儀進行細胞凋亡分析(圖4)，結果顯示，未處理組U87細胞的凋亡率為0.00% ±0.011%，格列衛處理組細胞的凋亡率為8.94% ±0.034%，STS處理組的細胞凋亡率為28.12% ±0.032%，而格列衛和STS雙處理組的細胞凋亡率為51.29%±0.098%。上述結果說明，格列衛能夠誘導細胞發生凋亡，并增加腫瘤細胞對凋亡誘導劑的敏感性，當與低劑量的凋亡誘導劑STS共同使用時，會出現協同誘導凋亡的效果。

圖4 不同處理的U87細胞株凋亡檢測

3 討論

格列衛作為全球首個獲得FDA批準上市的分子靶向抗癌藥物，目前作為治療慢性髓樣白血病一線藥物和不能手術切除的胃腸道間質腫瘤［7］。這種激酶抑制劑在其他實體腫瘤的應用方面也開展了很多的相關研究，如動物實驗證明，格列衛能夠有效抑制裸鼠的小細胞肺癌的生長，也能夠抑制裸鼠顱內膠質母細胞瘤的生長［8］。但是格列衛抑制實體腫瘤的作用機制尚未闡明。

本研究發現，格列衛處理膠質母細胞瘤U87細胞后，使Gal-3聚集到溶酶體中，并且Gal-3的蛋白量顯著降低，用溶酶體特異性抑制劑ConA能夠阻止Gal-3蛋白量的降低，說明Gal-3是通過溶酶體途徑發生了降解;檢測細胞凋亡率發現，格列衛有誘導U87細胞株凋亡的作用，同時格列衛的使用能夠使腫瘤細胞對凋亡誘導劑STS作用的敏感性增加，說明格列衛與凋亡誘導劑之間存在協同誘導細胞凋亡的作用。

格列衛作為酪氨酸激酶抑制劑能夠促使癌蛋白Gal-3發生溶酶體降解，說明Gal-3是受酪氨酸激酶調控的蛋白，激酶受到阻斷劑的抑制后，這種癌蛋白便進入溶酶體發生蛋白的降解，使得細胞更容易受凋亡誘導劑的誘導而發生細胞凋亡，一方面證明了Gal-3在膠質母細胞瘤中起著抗凋亡的作用，另一方面證明Gal-3可以作為該種腫瘤的治療靶標，這對于以Gal-3為靶標治療該種腫瘤和研究Gal-3在膠質母細胞瘤中的作用機理研究提供了重要的線索。

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［4］Bresalier RS，Yan PS，Byrd JC，et al.Expression of the endogenous galactose-binding protein galectin-3 correlates with the malignant potential of tumors in the central nervous system［J］.Cancer，1997，80(4):776-787.

［5］李祥龍.半乳糖凝集素-3在顱內腫瘤中的研究進展［J］.國際神經病學神經外科雜志，2011，38(4):389-392.

［6］張文博.半乳糖凝集素-3及其抑制劑的研究進展［J］.中國藥學雜志，2009，44(3):165-168.

［7］鄧蘭，劉鯤，李潔，等.格列衛治療后bcr/abl融合基因變異的研究［J］.實用醫學雜志，2012，28(1):117-119.

［8］余和平，徐晶.抗腫瘤藥物—格列衛［J］.世界臨床藥物，2003，24(8):503-506.