組蛋白去乙酰基酶在前列腺癌中的作用及機制研究

黃 勇 閆 駿 馬 敏

內蒙古醫科大學附屬醫院泌尿外科，內蒙古呼和浩特 010050

前列腺癌是一種常見于老年男性的惡性腫瘤，在歐美等地發病率位居惡性腫瘤首位[1]。組蛋白修飾是組織細胞發育、分化基因轉錄調控的關鍵分子機制，組蛋白修飾狀態改變在腫瘤發生及進展中具有重要作用。組蛋白修飾方式包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化修飾等[2－4]，核心組蛋白乙酰化水平的穩態是由組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白脫乙酰化酶（HDACs）之間的動態平衡調節的[5]。HDACs在許多異常活化的癌細胞中均存在，可阻抑細胞周期抑制因子的作用。組蛋白乙酰化狀態失衡參與眾多信號轉導通路調節，是細胞癌變中重要的轉錄后修飾過程[6]。因此，HDAC是重要的抗癌藥物靶點，在抗癌藥物研究中具有重要意義[6]。

丙戊酸（VPA）是一種HDAC抑制劑（HDACI）和抗癲癇藥物，可抑制Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白脫乙酰基轉移酶（HDACs）[7]。研究發現，長期服用VPA可減少前列腺癌癥細胞的增殖[8－10]。因此，本研究觀察了HDAC抑制劑VPA對在體前列腺癌移植體的作用，以期明確組蛋白去乙酰基酶在前列腺癌中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌的細胞系LNCaP購自American Type Culture Collection（Manassas，VA），雄性無胸腺 nu/nu 小鼠（20～25 g）購自天津醫科大學實驗動物中心。L－谷氨酰胺的 RPMI 1640 培養基為 Cellgro（Herndon，VA）公司產品，熱滅活胎牛血清購自 Life Technologies，Inc.（Carlsbad，CA），鹽酸環丙沙星和慶大霉素購自US Biological公司（Swampscott，MA），基底膠為 BD Biosciences（Palo Alto，CA）公司產品，VPA（1 mol/L 的 VPA 鈉鹽；Sigma，St.Louis，MO）。

一抗來源：乙酰化組蛋白H3為美國Upstate公司產品，p21WAF1/CIP1及雄激素受體（AR）為美國Santa Cruz公司產品，細胞周期蛋白D1為美國Ventana Medical Systems公司產品，p27KIP1為美國DAKO公司產品。

主要儀器：Leica CM 1850冰凍切片機為德國徠卡公司產品，Olympus BX51顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品。

1.2 腫瘤細胞株培養及移植瘤建立

細胞培養環境：含L－谷氨酰胺的RPMI 1640培養基，10%熱滅活胎牛血清，5 μg/mL的鹽酸環丙沙星和50 μg/mL慶大霉素。細胞生長至鋪滿培養基80%～90%時，用含0.05%胰蛋白酶的EDTA（0.53 mmol/L）收集細胞，細胞重懸在PBS（pH 7.4），與混合 1×基底膠（BD Biosciences，Palo Alto，CA）混勻，皮下注入（1×106/次）雄性無胸腺nu/nu小鼠，建立腫瘤移植體。

1.3 動物分組及處理

移植瘤建立后，動物隨機分成對照組和HDAC抑制劑組，每組6只。HDAC抑制劑VPA溶于PBS，經0.22 μm過濾器滅菌，HDAC抑制劑組受試動物接受0.4%w/v的VPA飲用水，對照組為不含VPA正常飲用水，35 d后切除腫瘤。

1.4 免疫組化染色

切除腫瘤移植體經福爾馬林液固定，組織塊依次浸入10%、20%、30%的蔗糖溶液脫水，然后經OCT包埋，行連續冠狀恒冷箱切片，厚度16 μm，組織切片經水化后，3%的過氧化氫孵育 10 min，PBS沖洗（3 min×3次），滴加馬血清封閉液，孵育10 min，一抗4℃孵育過夜（一抗使用濃度：乙酰化組蛋白 H3 為 1∶1000，p21WAF1/CIP1為 1∶500，細胞周期蛋白 D1 為 1∶1000，p27KIP1為 1∶1000，AR 為 1∶250），37℃復溫45 min，PBS洗 5 min×3 次，滴加相應二抗，37℃孵育 45 min，PBS沖洗，5 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件陽性細胞進行平均光密度（MOD）分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制HDAC對前列腺癌移植體組蛋白H3乙酰化的影響

給予VPA飲水后，腫瘤移植體乙酰化組蛋白H3與未處理的對照組相比，陽性染色細胞數明顯增加，乙酰化組蛋白H3水平顯著升高（P＜0.05），表明抑制HDAC可提高乙酰化組蛋白H3的表達。見圖1、表1。

2.2 抑制HDAC對前列腺癌移植體細胞周期的影響

免疫組化檢測結果表明：給予組蛋白乙酰化酶抑制劑VPA后，前列腺癌移植體細胞p21WAF1/CIP1水平顯著升高（P＜0.05，圖2、表1），提示細胞周期被有效阻滯；進一步對細胞周期蛋白D1及p27KIP1的檢測結果顯示，HDAC抑制劑組D1蛋白水平與對照組相比顯著下降（P＜0.05，圖2、表1），而p27KIP1表達水平則比對照組明顯增加（P＜0.05，圖2、表1），這進一步提示，抑制HDAC可明顯阻滯細胞周期，抑制癌細胞生長。

2.3 抑制HDAC對前列腺癌移植體AR表達的影響

AR是雄激素作用的中介，與前列腺癌的發生發展密切相關。本研究結果顯示，給予組蛋白乙酰化酶抑制劑VPA后，前列腺癌移植體細胞AR的表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05，圖3、表1），提示抑制HDAC可通過阻斷雄激素的作用途徑抑制前列腺癌細胞發展。

表1 抑制HDAC對前列腺癌移植體各標志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

表1 抑制HDAC對前列腺癌移植體各標志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

注：AR：雄激素受體

組別 H3 P21WAF1/CIP1P27KIP1細胞周期蛋白D1 AR對照組HDAC抑制劑組P值0.63±0.12 0.75±0.11 0.27±0.06 0.79±0.10 0.31±0.08 1.09±0.18 0.69±0.09 0.58±0.08 0.62±0.10 0.53±0.07 0.0360.0250.020.0430.046

3 討論

以HDAC為抑制靶標的藥物可重新激活沉默的腫瘤抑制基因，并具有選擇性、多效性的抗腫瘤作用[11]。大部分人類癌癥高度異質性，可能涉及許多不同的信號通路。體外和在體研究表明，HDACI可抑制多種活性[12-14]，長期服用HDAC抑制劑VPA可顯著減少前列腺癌細胞增殖，腫瘤體積明顯減小[8]。為了進一步探討HDAC在前列腺癌作用及機制，筆者研究了HDACI對異種移植前列腺癌細胞周期和增殖相關標志物表達的影響。

細胞周期由周期蛋白和周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）的相互作用而完成。 P21WAF1/CIP1是細胞周期負調節因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKI） 家族的一員，轉化細胞中p21WAF1/CIP1的表達對細胞周期阻滯起重要作用[15]，其可通過抑制Cyclin-CDK2復合體的活性及阻斷DNA復制阻滯細胞周期[16]。p27KIP1同樣被證實在阻滯G1期到S期細胞周期中發揮重要作用[17]。本研究結果證實，抑制HDAC可促進前列腺癌移植體細胞p21WAF1/CIP1和p27KIP1表達，表明HDAC與細胞周期相關蛋白密切相關，通過抑制HDAC而上調細胞周期負調節因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子的表達，可抑制癌細胞增殖。

Cyclin D1是G1～S細胞周期進程中重要的正向調控因子，其可通過與CDK4/6結合形成復合體而激活后者，進而使視網膜母細胞瘤抑制基因失活，加速癌細胞周期進程[18-19]。在多種腫瘤組織中，均發現Cyclin D1高表達。本研究結果顯示，抑制HDAC可降低前列腺癌移植體細胞Cyclin D1表達水平，這可能是HDACI抑制癌細胞增殖的機制之一。

前列腺癌的生長是雄激素依賴性的，AR及其信號轉導通路在前列腺癌的發生發展中具有重要作用，AR高表達可增強前列腺癌細胞對低水平雄激素的敏感性，進而導致前列腺癌在抗雄激素治療一段時間后，大多數最終發展為雄激素非依賴性前列腺癌[20-22]。本研究表明，抑制HDAC可下調前列腺癌移植體細胞AR表達水平，這提示HDACI可通過AR信號轉導通路抑制癌細胞生長。

綜上，HDAC參與前列腺癌細胞的細胞周期調控并與AR過表達有關，HDACI可通過誘導癌細胞周期阻滯及下調AR表達水平等機制抑制前列腺癌腫瘤移植體生長，HDAC可作為前列腺癌治療藥物的研制靶標。

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