硫酸氨基葡萄糖膠囊對兔膝關節軟骨細胞凋亡的影響觀察

林宗漢 黃保華 黎 強 容向賓 龍飛攀 梁慶華 曾憲輝 鄭鐵牛

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院骨科，廣西南寧 530011；2.廣西中醫藥大學，廣西南寧 530001

口服硫酸氨基葡萄糖治療膝關節骨關節炎（osteoarthritis of the knee，簡稱膝OA）在我國較為普遍，歐洲風濕病協會和國際骨關節炎研究協會治療膝關節骨性關節炎亦推薦應用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然而也有國外學者認為“很少有證據表明，氨基葡萄糖能促進關節軟骨功能恢復”[3]。為觀察其作用效果，本試驗通過膝OA動物模型實驗，從細胞組織形態學探討硫酸氨基葡萄糖膠囊對兔膝關節軟骨細胞凋亡的影響，進而初步評價硫酸氨基葡萄糖膠囊在膝OA防治中可能發揮的作用，為臨床治療提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

6月齡雌性新西蘭兔30只，體重2.5～3.0 kg，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供 [實驗動物使用許可證SYXK（桂）2003-0001]。

1.1.2 實驗儀器

脫水機（ASP300S型，德國 Leica公司）；包埋機（EG1160型，德國 Leica公司）；光學顯微鏡（CX31型，日本OLYMPUS 公司）；切片機（RM2235 型，德國 Leica公司）；漂片、烤片機（CS-Ⅲ型，孝感亞鵬公司）；圖文分析系統（HMIAS-2000型，武漢千屏醫學影像技術有限責任公司）。

1.1.3 實驗藥品

硫酸氨基葡萄糖膠囊，規格每粒0.314 g（浙江海正藥業股份有限公司，國藥準字H20041316），TUNEL試劑盒（美國羅氏公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

隨機分為硫酸氨基葡萄糖膠囊（簡稱藥物組）、模型對照組（簡稱對照組）、正常組共三組，每組10只動物。

1.2.2 造模

藥物組、對照組共20只兔均使用1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，兔耳緣靜脈注射，參照改良Huith法的造模方法，于無菌條件下切斷兔右膝內側副韌帶、前后交叉韌帶及切除內側半月板，縫合傷口，無菌敷料復蓋，術后連用3 d青霉素鈉（每天5萬U/kg）、鏈霉素（每天10萬U/kg）。術后1周始軀趕兔子每天行走2次，共30 min，連續4周。

1.2.3 給藥

根據Meeh-Rubner公式計算，藥物組給予硫酸氨基葡萄糖膠囊每只0.628 g/d，用生理鹽水配成30 mL液體灌喂，連用8周；對照組和正常組每日30 mL生理鹽水灌喂，連用8周。所有動物單籠飼養，飼養至4周時藥物組、對照組各有1只兔子死亡，正常組有3只兔子死亡，予以剔除。造模后12周末分別處死所有動物。

1.2.4 取材

在原料（g）∶水（mL）∶氨水（mL）為1.00∶2.10∶0.40、反應溫度為80℃、反應時間為60min、攪拌速度為100r/min、自然冷卻6h的條件下，考察機械球磨對直收率的影響，結果如表4所示，并進行了相關分析。

所有動物于造模后12周末取材。耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖右膝關節，肉眼觀察關節軟骨組織大體變化，后使用咬骨鉗、手術刀取內側脛骨平臺軟骨組織放入4%多聚甲醛中備檢。

1.2.5 指標檢測

1.2.5.1 HE染色 右膝內側脛骨平臺4%多聚甲醛固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋，連續切片（厚度 3 μm），蘇木精-伊紅染色，封片，光鏡下觀察軟骨形態變化。

1.2.5.2 原位末端標記法檢測軟骨細胞凋亡率 切片常規脫臘至水，用蛋白酶K室溫孵育30 min，PBS洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃孵育60 min（為防止蒸發和保證TUNEL反應混合物均勻分布，在孵育過程中加蓋蓋玻片），PBS沖洗3次。擦干樣品周圍水分，加入50 μL轉化劑 POD，在濕盒中 37℃孵育30 min（為防止蒸發和保證轉化劑POD（辣根過氧化物酶）均勻分布，在孵育過程中加蓋玻片）。PBS沖洗3次，加入100 μL DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，封片。在光學顯微鏡下觀察，以細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞（即凋亡細胞）。每個標本選擇細胞分布較均勻的高倍視野10張片計數，分別計數陽性細胞；軟骨細胞凋亡率（%）=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

2.1.1 藥物組

關節面光滑，軟骨透明，有光澤，未見明顯缺損及新生物。切面見軟骨厚度正常或稍增厚。

關節面粗糙，凹凸不平，軟骨面顏色灰黃，無正常透明度及光澤，可見明顯缺損及骨贅形成。切面見軟骨變薄明顯。

2.1.2 正常組

關節軟骨表面光滑完整，呈乳白色或淡藍色，半透明狀。

2.2 組織病理學觀察

2.2.1 藥物組

大部分動物軟骨表面光滑平整，局部可見小裂隙，四層結構基本清晰。部分動物軟骨層增厚，表、中層細胞增多，排列稍紊亂。潮線清晰完整（圖1a）。

2.2.2 對照組

軟骨表面不光滑，可見深達輻射層的糜爛及缺損，周圍軟骨見簇狀增生，局灶骨贅形成。四層結構紊亂。軟骨層厚度不均，大部分軟骨層明顯變薄，軟骨細胞減少。潮線扭曲紊亂（圖1b）。

2.2.3 正常組

關節軟骨各層次明確，其中表層軟骨細胞呈類圓形，排列近似水平狀，分布較均勻；中間層（移行層與輻射層）軟骨細胞為圓形，呈散在、無序排列，有聚集現象；鈣化層軟骨細胞呈柱狀排列，細胞較少，未見軟骨細胞簇集，潮線完整（圖1c）。

2.3 兔軟骨組織細胞凋亡情況

動物膝關節軟骨細胞凋亡見圖2，凋亡率見表1。結果顯示，藥物組細胞凋亡率比正常組高，比對照組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。

表1 兔子膝關節軟骨細胞凋亡率（%，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.01；與正常組比較，◇P＜0.01

組別 只數 凋亡率藥物組對照組正常組997 16.61±2.14△◇30.50±4.72 4.67±1.85△

3 討論

目前對膝OA的病因尚未完全明了，大多數OA的發病缺乏已知病因，但一般認為該病的始發部位在軟骨[4]。軟骨組織的損傷啟動并影響著膝OA發生、發展的整個病程。有學者[5-6]認為骨關節病炎發病與滑膜、軟骨細胞的凋亡有關。細胞凋亡即程序性細胞死亡，通常認為導致細胞凋亡的程序在機體內、外因素作用下被啟動，導致細胞凋亡的發生。正常軟骨細胞的凋亡參與細胞數量的調節，在軟骨發育和關節區的穩態調節中發揮重要的作用，但過度凋亡則是病理的和有害的。已有研究發現軟骨細胞的過度凋亡與軟骨組織損傷有密切關系[7-9]。本實驗通過右膝內側副韌帶、前后交叉韌帶及切除內側半月板造成膝關節內環境損傷，建立并觀察軟骨細胞凋亡模型。

硫酸氨基葡萄糖治療膝關節骨關節炎一直存在爭議，歐洲風濕病協會和國際骨關節炎研究協會治療膝關節骨性關節炎推薦應用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然在2009年一項綜述認為“很少有證據表明，氨基葡萄糖能促進關節軟骨功能恢復”[3]。一些學者做了相關的基礎研究，認定硫酸氨基葡萄糖有一定的療效，并且在歐洲得到肯定。硫酸氨基葡萄糖作用機制研究如下：①硫酸氨基葡萄糖能控制軟骨葡萄糖胺聚糖和蛋白多糖合成的速度，從而促進蛋白多糖的生物合成，保護與修補軟骨基質和恢復受損的軟骨細胞；②硫酸氨基葡萄糖可以調節膠原酶[10]和磷脂酶A2的活性，減少損傷細胞的內毒性因子釋放，還可以通過減少降解、促進合成而恢復葡萄糖胺聚糖的代謝失衡；③硫酸氨基葡萄糖能抑制促炎癥細胞因子表達，減少關節的破壞和炎性反應。硫酸氨基葡萄糖作用是否對膝關節軟骨細胞凋亡產生影響，目前尚缺乏類似的基礎研究。

本組實驗的對照組在宏觀的解剖形態和組織病理學觀察發現膝關節軟骨受損嚴重，同時從過微觀顯微鏡下觀測軟骨細胞軟骨細胞凋亡率達到（30.50±4.72）%，光鏡顯示軟骨組織損傷明顯。而藥物組細胞凋亡率較對照組明顯要低，兩者差異有高度統計學意義（均P＜0.01），光鏡顯示軟骨組織損傷較輕。本實驗證實硫酸氨基葡萄糖與膝關節軟骨凋亡有關，可減輕兔膝關節軟骨組織的損傷及軟骨細胞的凋亡，其具體的作用機制尚需要進一步深入研究。結合目前的臨床使用與一些基礎研究文獻[11-13]提示，硫酸氨基葡萄糖治療膝OA效果確切，值得臨床醫生重視。

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