痰熱清注射液抑制HepG2細胞的研究

李永偉 楊躍武 陸慧瓊

中山大學附屬第三醫院中醫科，廣東廣州 510630

痰熱清注射液屬國家新藥中藥二類，方中以黃芩為君藥，熊膽粉、山羊角為臣藥，金銀花為佐藥，連翹為使藥[1]，具有清熱、解毒、化痰等功效，主治急性支氣管炎、急性肺炎（早期）出現的痰熱阻肺癥狀，但其主要藥物如黃芩、熊膽粉、山羊角俱為歸于肝膽經的藥物，其中，綠原酸對肝癌還具有顯著的抑制作用[2]，但未見痰熱清復方注射液用于治療肝癌的相關文獻報道。中山大學附屬第三醫院臨床采用痰熱清注射液治療中醫證型辨證為肝膽濕熱的肝炎、肝硬化和肝癌在內的多種肝臟疾病，結果顯示可減少肝癌介入栓塞術后綜合征，如發熱、腹痛、嘔吐等癥狀[3]。本研究初步觀察了痰熱清注射液對肝癌細胞株HepG2生長及細胞周期的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養基（GIBCO 公司），MTT（Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），96孔、6孔培養板及25 cm2培養瓶（COSTER 公司），酶標儀（BIO-RAD、Model450 MICRoPLATE READER），痰熱清注射液由上海凱寶藥業有限公司生產，批準文號：國藥準字Z20030054。

1.2 細胞抑制率檢測

采用MTT法。

1.2.1 細胞培養及藥物濃度設定 收集復蘇后培養傳代5代以內對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔板中每孔加入200 μL鋪板，使待測細胞密度調至5000個/孔。細胞生長48 h后，根據多次預實驗結果，將痰熱清注射液按原藥物濃度用DMEM倍比稀釋成8個濃度梯度：40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/L，并設空白對照組，每組設4個復孔，實驗重復3次。

1.2.2 細胞抑制率測定 加入藥物后培養48 h，先棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 3遍后，每孔加入 20 μL MTT溶液（5 mg/mL），加培養液繼續培養4 h后吸去孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值。檢測時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜）、對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），并另設不加MTT的對照孔（即細胞、相同濃度的藥物、培養液、二甲基亞砜），實驗孔吸光值減去不加MTT的對照孔值為矯正后的實驗孔值。細胞抑制百分率（%）=（細胞對照組平均A值-實驗組平均A值）/細胞對照組平均A值×100%；細胞半數有毒濃度（TC50）=antilog[B+（50-B）/（AB）×C]；A=log（＞50%藥物含量）；B=log（＜50%藥物含量）；C=log（稀釋倍數）[4]。

1.3 細胞周期檢測

采用凱基細胞DNA含量（細胞周期）即時檢測試劑盒。

1.3.1 細胞培養及分組 將HepG2細胞鋪于6孔板，細胞調密度至1×105/孔，采用DMEM混合培養液（含10%胎牛血清 ），置5%CO2培養箱中37℃培養，48 h后按照 TC50加入濃度分別為2.5、1.25、0.625 mg/L的痰熱清注射液，并加培養液至2 mL，再培養48 h后收集細胞行流式細胞儀檢測，每組3個復孔，同時設立空白對照組。

1.3.2 細胞周期檢測 收集106個細胞，用1 mL PBS重新懸浮，離心后棄上清；加入0.5 mL Solution Buffer懸浮細胞，離心棄上清；再加入0.5 mL Solution Buffer懸浮細胞，離心棄上清；加入 250 μL Solution A，25℃孵育 10 min；加入200 μL Solution B，25℃孵育 10 min；最后加入 200 μL Solution C，4℃避光10 min；上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。取各劑量組均數計算細胞增殖指數，細胞增殖指數=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用Probit分析計算TC50，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰熱清注射液對HepG2細胞增殖的抑制情況

痰熱清注射液對HepG2細胞增殖的抑制實驗結果顯示，不同濃度的痰熱清對HepG2細胞均有不同程度的抑制作用，隨著藥物濃度增高，抑制作用逐漸增強。痰熱清注射液對HepG2細胞的TC50為3.62 mg/L。痰熱清注射液作用48 h后對HepG2細胞的生長抑制情況見圖1。

2.2 痰熱清注射液對HepG2細胞周期的影響

結果顯示，2.5 mg/L組痰熱清注射液使細胞阻滯于G0/G1期，該期細胞比率明顯高于其他組（P＜0.01），其他各組間G0/G1期細胞比率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；各組G2/M期細胞比率差異無統計學意義（P＞0.05）；2.5 mg/L組S期細胞比率明顯低于其他組（P＜0.01），1.25 mg/L組S期細胞比率亦明顯低于空白對照組（P＜0.05）；2.5 mg/L組細胞增殖指數明顯低于其他組（P＜0.01）；各組細胞均未見明顯的凋亡峰。見表1、圖2。

表1 痰熱清注射液對HepG2細胞周期及增殖指數的影響（±s）

表1 痰熱清注射液對HepG2細胞周期及增殖指數的影響（±s）

注：與 2.5 mg/L 組比較，*P ＜ 0.01；與空白對照組比較，¤P ＜ 0.05；PI：增殖指數

組別 G0/G1期（%） S期（%） G2/M期（%） PI空白對照組0.625 mg/L組1.25 mg/L組2.5 mg/L組55.02±0.19*59.05±0.67*57.64±0.25*68.27±2.01 29.28±1.21*26.86±0.14*26.05±0.1*¤19.21±0.39 15.71±1.4 14.9±0.77 15.5±0.4 12.53±1.6 44.98±0.19*40.95±0.68*42.36±0.26*31.74±2.03

3 討論

痰熱清注射液中4種主要成分為綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，鵝去氧膽酸為需要限量的毒性成分[5]，前三者均具有利膽作用，且值得注意的是，這三種成分均有抑制腫瘤作用的報道。熊去氧膽酸對HepG2細胞株具有抑制作用，可促使其凋亡，阻滯細胞增殖周期于G0/G1期。動物實驗結果顯示，熊去氧膽酸可以預防實驗大鼠肝癌的發生，明顯減少大鼠肝癌結節的數量[6]。黃芩苷可抑制肝癌HepG2細胞增殖，誘導細胞凋亡，使多數細胞阻滯于S期[7]。痰熱清注射液中綠原酸含量約為6.0 g/mL[8]，綠原酸可通過抑制細胞生長、調節細胞周期、誘導凋亡等途徑產生抗癌作用[9]。在肝癌細胞系Hep3B中，綠原酸的半數有效抑制濃度（IC50）只需達到30～50 nmol/L即可產生良好的抗金屬蛋白酶9（MMP-9）的功效，因此，其可能具有抑制肝癌轉移的作用。甲基四氮鹽實驗研究表明，綠原酸無細胞毒性[10]。動物實驗顯示，綠原酸可抑制化學物質對肝臟的致癌作用[11]。痰熱清注射液含有上述三種具有抑癌作用的成分，但因痰熱清注射液各批次成分含量差異[5]，因此，其抑癌作用結果需要多次重復實驗。

本研究結果顯示，痰熱清注射液8個濃度梯度對肝癌細胞均有抑制作用，并隨劑量的增加抑制作用增強，其機制可能與痰熱清注射液將細胞阻滯于G0/G1期，致細胞DNA合成減少有關，前者與熊去氧膽酸作用類似，但用于細胞周期檢測的3個濃度并未顯示出促凋亡的作用，因此，需要進一步研究該復方注射液的抗癌機制。雖然痰熱清導致細胞DNA合成減少，但已合成DNA的細胞仍可進入有絲分裂，導致各組細胞有絲分裂期的結果差異無統計學意義。

用于檢測細胞增殖活力的CCK-8法較MTT法有突破性的改變，如MTT被還原成的甲臜需要二甲亞砜溶解，而CCK-8不需要加入后者；CCK-8中酚紅和血清對測定無明顯影響，不必去上清洗滌細胞，更加簡便，也使結果數據更準確及穩定。但對于本身為棕紅色透明液體的痰熱清會影響吸光度值，即使不加MTT和細胞，也與實驗孔的吸光度值相近，甚至高于實驗孔。因此，本研究仍采用了MTT法檢測細胞增殖情況，PBS沖洗細胞3次，并設計了矯正后的實驗孔值以消除藥物本身的影響。

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