棕色脂肪干細胞與白色脂肪干細胞移植對心肌梗死大鼠心功能的影響

石金鑫 劉劍鋒 王海濱 朱 平▲

1.解放軍總醫院南樓心一科，北京 100853；2.軍事醫學科學院基礎醫學研究所前沿交叉學科研究室，北京 100850

急性心肌梗死可在短時間內引起心肌細胞的大量死亡，心肌細胞的損傷嚴重程度取決于幾個因素：初始梗死的大小、持續時間及是否有效微血管再灌注[1]。大量的實驗研究表明，干細胞治療能夠提高心臟功能，促進心肌再生。骨髓間充質干細胞作為最常用的種子細胞之一，因其心肌分化效率很低，治療心肌梗死修復主要通過旁分泌機制而非心肌再生，而使心臟修復得不到長期改善[2]。因此，心肌再生能力對于心肌梗死后修復至關重要。

脂肪來源干細胞，因其具有取材方便、易于擴增及免疫原性弱等優勢，已成為目前研究的熱點[3]。脂肪組織分為白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪干細胞（white adiposederived mesenchymal stem cells，ADSCs）作為常用種子細胞之一，能夠促進心肌梗死區新血管生成，提高受損心肌周圍微血管再灌注，防止梗死后心肌細胞大量死亡[4]。棕色脂肪來源干細胞（brown adipose-derived mesenchymal stem cells，BADSCs）作為一種新來源的種子細胞，逐漸引起關注。有研究報道，從棕色脂肪中分離的干細胞具有較高的成心肌分化能力，且可在體外自發的分化為有功能的心肌細胞[5]。在筆者既往研究中發現，通過組合消化酶法能夠高效的從幼年SD大鼠肩胛骨下脂肪中分離出BADSCs，并且能夠在體外使其分化為功能性心肌細胞[6]。然而，BADSCs能否在心肌梗死大鼠中有效分化為心肌細胞，且是否比ADSCs更具優勢，目前尚未明確。本研究擬開展兩種不同脂肪來源干細胞移植治療大鼠心肌梗死的研究，旨在比較其改善心臟功能的效果，并探討兩者在梗死組織中促血管化作用及向心肌分化能力的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本研究采用隨機對照動物實驗。雄性SD大鼠[（80±20）g]用于體外分離脂肪組織，雄性 SD 大鼠（250 g左右）用于構建心肌梗死模型。所有動物均由北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及抗體 CD29、CD45、CD90（Biolegend），CD31、cTnT、vWAg（Sigma），Dispase Ⅱ（Roche，Germany），Ⅳ型 膠原酶（Sigma，USA，JF0710），α-MEM（Gibco，USA，1342877），胎牛血清（FBS）（MDgenics InC，USA，062010），胰酶（Gibco，USA）

1.2 方法

1.2.1 BADSCs及ADSCs的分離培養及分選鑒定 取80 g左右雄性SD大鼠，無菌條件下分別在肩胛骨下和腹股溝處取出脂肪組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍；剪碎后分別加入0.05%胰酶+0.1%Ⅳ型膠原酶+0.1%DispaseⅡ混合消化，37℃攪拌45 min，使用含10%的血清培養基終止消化，并通過200目的濾網過濾，紅細胞裂解液去除紅細胞，終止消化后，600 g離心5 min，分別重懸接種，隔天換液。流式細胞儀進行分選，BADSCs使用細胞表面標志物CD90、CD45鑒定，ADSCs使用CD29、CD31鑒定（以上抗體均按廠家說明加入）。

1.2.2 BADSCs成心肌分化能力鑒定 BADSCs以2.5×104/cm2的細胞密度接種，分化2周后進行免疫組化檢測。免疫組織化學檢測采用兩步法試劑盒，使用工作濃度的一抗cT-nT（1∶200 ），以 PBS 代替一抗作為陰性對照，DAB 顯色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 ADSCs多向分化潛能鑒定 P3代ADSCs長至75%匯合后，加入成骨和成脂誘導培養液培養。對照組培養基即為ADSCs生長培養基。成脂誘導液是培養基中添加0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L吲哚美辛；成骨誘導液是培養基中添加地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉。成脂、成骨分化分別以油紅O和茜素紅染色進行鑒定。

1.2.4 移植細胞標記 移植前1天BADSCs、ADSCs密度達到60%～70%時進行慢病毒載體轉染，具體方法參見文獻[7]。熒光顯微鏡下觀察單體紅色熒光蛋白（RFP）的表達，大約90%以上細胞可表達mRFP。

1.2.5 大鼠心肌梗死模型制備及細胞移植 大鼠急性心肌梗死模型的制備采取冠狀動脈左前降支結扎法。結扎成功后，將心肌梗死大鼠隨機分為 3 組：PBS 對照組（n=10，100 μL）、ADSCs 移植組（n=10，100 μL）、BADSCs 移植組（n=10，100 μL）。在梗死區的周邊選擇3個注射位點（梗死區兩側與心尖部位）將各組細胞直接注入，采用28-gauge注射針頭。

1.2.6 心功能檢測 術后4周進行心臟超聲檢測心臟功能，由二維圖像引導取M型曲線并進行測量，測量左心室收縮末期直徑（LVESD）、舒張末期直徑（LVEDD）。 左心室短軸縮短指數（FS）=[（LVEDD-LVESD）/LVESD]×100%；左心室射血分數（EF）=[（LVEDD3-LVESD3）/LVESD3]×100%。

1.2.7 組織學檢測 心功能檢測后處死動物，取心肌組織，4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，行馬松三色（MASSON）染色、免疫組織化學染色和免疫熒光染色。免疫熒光染色使用工作濃度的一抗cTnT（1∶200），免疫組織化學染色使用工作濃度的一抗vWF（1∶200），對照組PBS替代一抗。微血管密度計數：vWAg染色陽性，位于心肌梗死部位，管腔可視并且血管直徑在20～100 μm的微血管進行計數，取平均值。每個標本取5張切片，每張切片取5個高倍視野。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 棕色脂肪干細胞特征及表面標記

BADSCs分離后進行流式細胞儀測定，結果顯示細胞表達CD90陽性，造血系標記CD45陰性。大約培養2周后，顯微鏡下可觀察到形態拉長、呈肌細胞搏動形態的細胞，并呈現自發的有力的搏動。進一步進行免疫熒光學鑒定，發現這種肌細胞樣的搏動細胞表達心肌特異性標志物cTnT（圖1、2）。

2.2 白色脂肪干細胞特征及表面標記

ADSCs貼壁后類似成纖維樣細胞，呈梭形生長。P3代ADSCs進行流式細胞儀檢測結果顯示，細胞表達CD29陽性，CD31陰性。ADSCs加入成脂誘導液培養2周后進行油紅O染色，顯微鏡下可見大量紅色脂滴；成骨分化4周進行茜素紅染色可觀察到陽性的鈣化結節，這些表明ADSCs具有多向分化潛能（圖1、2）。

2.3 心功能檢查結果

超聲心動圖檢測結果顯示，ADSCs移植組以及BADSCs移植組均可以改善梗死心肌的心功能，與PBS對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；ADSCs移植組和BADSCs移植組相比，兩者心功能指標差異無統計學意義（P ＜ 0.05）。 見圖3。

2.4 組織學檢查結果

2.4.1 心肌梗死區域膠原沉積檢測 MASSON染色進行心肌梗死區膠原沉積檢測，PBS對照組為（63.4±4.6）%，ADSCs移植組為（48.7±4.1）%，BADSCs移植組為（46.1±3.4）%。由此可說明，ADSCs移植組和BADSCs移植組均能顯著減弱心肌梗死區纖維化程度，與PBS對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4.2 新生微血管檢測 在抗 vWAg免疫組化染色的切片上計數心肌梗死區微血管密度結果顯示，PBS對照組為（98.6±9.4）/mm2，ADSCs 移植組為（239.6±17.9）/mm2，BADSCs移植組為（215.4±16.7）/mm2。 與 PBS 對照組血管密度比較，ADSCs移植組及BADSCs移植組心肌梗死區微血管密度均顯著增加（P＜0.05），其中，ADSCs移植組心肌梗死區微血管密度高于BADSCs組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.4.3 移植細胞在心肌梗死環境下的分化 細胞移植4周后，ADSCs移植組與BADSCs移植組均能在心肌梗死周邊區域觀察到共表達cTnT蛋白和mRFP蛋白的細胞，即同時表達綠色熒光與紅色熒光的細胞。BADSCs移植組更多見紅色與綠色熒光共表達的細胞，這說明BADSCs移植組在心肌梗死環境中的心肌分化程度明顯高于ADSCs移植組。BADSCs能否向血管譜系細胞分化有待進一步研究。見圖6。

3 討論

心臟自身具有有限的再生能力。心肌梗死后，損傷的心肌細胞被巨噬細胞大量清除并被瘢痕組織取代，這些瘢痕組織由收縮能力較差的存活細胞包繞，從而引起心力衰竭甚至死亡。研究表明，移植的不同類型干細胞可以通過旁分泌途徑來修復受損心臟，然而，干細胞的旁分泌作用并不會實現真正的心臟再生[8]。干細胞是否可以在體內有效地轉化為功能性的心血管譜系細胞值得重視。BADSCs是近年來發現的一種新的種子細胞來源。2004年Planat-Bénard等[9]首次從小鼠腹股溝及肩胛骨下脂肪中分離出的細胞能夠自發的分化為有功能的心肌細胞，隨后，Yamada等[10]的研究證實，這種具有較高成心肌分化潛能的細胞主要存在于棕色脂肪組織，從棕色脂肪中分離的CD133陽性和CD29陽性干細胞具有高度自發分化心肌細胞的能力。為了進一步證實BADSCs是否在體內移植后仍具有較強的心肌分化能力及心肌梗死修復潛能，本研究開展了兩種脂肪來源干細胞心肌梗死移植及其修復效果的比較研究。

已有文獻報道，ADSCs移植入病損組織會分泌細胞因子和生長因子，以旁分泌的方式刺激心肌修復[11]。本研究亦證實，ADSCs能夠通過其促血管化作用來提高心肌梗死的修復效果。雖然BADSCs的促血管化作用不如ADSCs，但BADSCs移植后的心功能改善作用與ADSCs無明顯差異。鑒于BADSCs具有高度的心肌分化潛能，本研究比較了其與ADSCs在體內的心肌分化能力，結果表明，BADSCs體內移植后仍可以分化為心肌細胞，且相較于ADSCs在心肌梗死環境下有更強的心肌再生能力。然而，BADSCs來源的心肌細胞是否能與宿主心肌在功能上偶聯，尚有待進一步研究。除此之外，BADSCs也可以通過旁分泌作用促進梗死心肌的修復。Liu等[6]證實，BADSCs可分泌多種細胞因子，如促血管生成因子VEGF、抗凋亡因子HGF、抗纖維化因子bFGF等，參與促進血管新生、減少心肌細胞凋亡、抗心肌纖維化、減輕炎癥反應等修復過程。本研究也證實，BADSCs具有一定的促血管化作用。盡管如此，目前，棕色脂肪在成人體內數量很少，然而隨著人們對干細胞基礎生物學研究的不斷深入，有研究發現，棕色脂肪與白色脂肪在一定條件下能夠互相轉換，從而有望解決棕色脂肪干細胞的來源問題[11]。

本研究證實，BADSCs相較于ADSCs具有如下優勢：①高度的成心肌分化能力，可作為優良的心肌再生種子細胞。②與ADSCs有相似的旁分泌潛能。本研究為BADSCs用于心肌梗死移植治療提供了新的數據。

[1]Clement C，Keith M，Channon，et al.Angiogenesis in the infarcted myocardium[J].Antioxid Redox Signal，2013，18（9）：1100-1113.

[2]Gnecchi M，Danieli P.Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells express cardiomyogenic proteins but do not exhibit functional cardiomyogenic differentiation potential[J].Stem Cells Dev，2012，21（13）：2457-2470.

[3]Zhu Y，Liu T，Song K，et al.Adipose-derived stem cell：a better stem cell than BMSC [J].Cell Biochemistry and Function，2008，26（6）：664-675.

[4]Pinheiro CH，De Queiroz JC.Local injections of adipose-derived mesenchymal stem cells modulate inflammation and increase angiogenesis ameliorating the dystrophic phenotype in dystrophin-deficient skeletal muscle[J].Stem Cell Rev，2012，8（2）：363-374.

[5]Yoshihiro Y，Wang XD.Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，342（2）：662-670.

[6]Liu ZQ，Wang HB.Efficient isolation of cardiac stem cells from brown adipose [J].Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010，2010： 104296.

[7]Liu ZQ，Wang HB.The influence of chitosan hydrogel on stem cell engraftment，survival and homing in the ischemic myocardial microenviroment[J].Biomaterials，2012，33（11）：3093-3106.

[8]Segers VF，Lee RT.Stem-cell therapy for cardiac disease[J].Nature，2008，451（7181）：937-942.

[9]Planat-Bénard CV，Menard.Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells[J].Circ Res，2004，94（2）：223-229.

[10]Yamada Y，Yokoyama S.Cardiac stem cells in brown adipose tissue express CD133 and induce bone marrow nonhematopoietic cells to differentiate into cardiomyocytes[J].Stem Cells，2007，25（5）：1326-1333.

[11]Jeffrey M，Gimble，Adam J，et al.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circulation Research，2007，100（9）：1249-1260.