大鼠骨癌痛模型中血-脊髓屏障通透性的變化

董 巖 楊長江 毛應(yīng)啟梁 方 波 馬 虹▲

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽 110001；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合系，上海 200032

血脊髓屏障與血腦屏障相似是由內(nèi)皮細(xì)胞通過緊密連接組成的，外面有星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的血管終足包繞，在局部保持了脊髓內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。近來的研究表明，血脊髓屏障的破壞與疼痛有密切的關(guān)系，在炎性痛及神經(jīng)痛的動物模型中都發(fā)現(xiàn)了血脊髓屏障的破壞[2-3]。骨癌痛作為一種機制獨特的疼痛，具有炎性痛和神經(jīng)痛的成分，但是又不單單是兩者的混合。因此，本實驗觀察了脛骨癌痛模型中血脊髓屏障的狀態(tài)及作為血脊髓屏障組成部分的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及形態(tài)變化，這一研究有利于揭示癌痛的發(fā)生及維持機制，為癌痛的治療提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雌性Wistar大鼠，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心。體重70～80 g 10只用于培養(yǎng)腹水瘤；體重160～180 g 69只，隨機分為三組，正常組13只（不實施手術(shù)），骨癌痛組28只（脛骨內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞）及假手術(shù)組28只（脛骨內(nèi)注射PBS），其中每組8只進(jìn)行痛行為學(xué)實驗，其余按時間點取脊髓腰膨大進(jìn)行免疫組化實驗。動物分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜交替，室溫控制在（22±1）℃，自由飲水?dāng)z食，在實驗環(huán)境中適應(yīng)1周后進(jìn)行實驗。在對動物實施外科手術(shù)及進(jìn)行疼痛研究的實驗過程中，嚴(yán)格遵守國際疼痛協(xié)會（IASP）有關(guān)動物保護(hù)的規(guī)定。

1.2 脛骨癌痛模型制作方法

制作模型應(yīng)用的腫瘤細(xì)胞是來自于Wistar大鼠的Walker 256乳腺癌細(xì)胞（購自上海生物醫(yī)學(xué)工程研究所）。復(fù)蘇腹水瘤細(xì)胞，取1 mL（約2×107個細(xì)胞/mL）接種至幼年70～80 g雌性Wistar大鼠腹腔內(nèi)，7～10 d后抽取腹水，離心清洗后以PBS重懸計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107個細(xì)胞/mL。腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉160～180 g大鼠，右側(cè)膝關(guān)節(jié)部備皮，70%酒精消毒皮膚。左手固定膝關(guān)節(jié)，用7號針頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔，深約1 cm，然后換用吸有腫瘤細(xì)胞的微量進(jìn)樣器，往骨癌痛組大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)注射4 μL腫瘤細(xì)胞，假手術(shù)組大鼠注射等量PBS，最后均推入2 μL凝膠海綿溶液封口，留針30 s。正常組大鼠不實施手術(shù)。癌痛模型以接種腫瘤細(xì)胞側(cè)脛骨內(nèi)出現(xiàn)腫瘤組織為模型成功標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 機械性痛覺超敏測定

安靜環(huán)境中，室溫20～22℃，大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機玻璃盒子內(nèi)，適應(yīng)20 min后，待動物處于放松狀態(tài)時開始檢測，采用一系列 von-Frey 細(xì)絲（1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g），從小到大垂直刺激大鼠后肢足掌中心部位。最小能引起縮爪反應(yīng)的纖毛壓力即為大鼠的縮爪反應(yīng)閾值，以此來反映大鼠的機械性痛覺超敏情況。具體操作方法見參考文獻(xiàn)[5]。按上述方法術(shù)后第2天開始隔天測定大鼠機械性痛閾值直至術(shù)后第16天。

1.4 免疫組織化學(xué)實驗

大鼠在10%水合氯醛（4 mL/kg，腹腔注射）麻醉下，經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定后，取出脊髓腰膨大節(jié)段，置入20%的蔗糖中4℃過夜，然后換入30%蔗糖（4℃），直至組織沉底，OCT包埋，冠狀冰凍切片，片厚25 μm，收集切片于0.01 mol/L PBS中，封閉液37℃孵育2 h；然后與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（Sigma 公司，1∶500）抗體或白蛋白抗體（Sant Cruze公司，1∶50）4℃孵育過夜；0.01 mol/L PBS 漂洗后依次加入生物素化的二抗、親和素-生物素-過氧化物酶孵育，3，3-二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。顯色完成后將切片置于載玻片上，干燥，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。采用雙盲法人工計數(shù)脊髓背角陽性細(xì)胞的數(shù)量，每個動物取5張脊髓切片，每組5個動物。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.3統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓背角白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量的變化

正常組大鼠及假手術(shù)組大鼠脊髓內(nèi)沒有檢測出白蛋白免疫陽性細(xì)胞，在接種腫瘤細(xì)胞后，骨癌痛組造模側(cè)的脊髓背角內(nèi)能夠觀察到陽性細(xì)胞及較彌散的顆粒，在術(shù)后第16天陽性細(xì)胞的數(shù)量增長較多，細(xì)胞的形態(tài)也更加清晰，且在對側(cè)也有同樣的變化趨勢（表1，圖1）。

表1 三組脊髓背角內(nèi)白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化情況（±s，個）

表1 三組脊髓背角內(nèi)白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化情況（±s，個）

注：與同側(cè)正常組比較，**P＜0.01

組別 星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量造模側(cè) 對側(cè)白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量造模側(cè) 對側(cè)正常組假手術(shù)組骨癌痛組術(shù)后第4天術(shù)后第8天術(shù)后第12天術(shù)后第16天?55±10 60±8 61±7 68±5 00 00 165±15**189±19**243±16**237±13**148±12**179±14**206±18**229±16**35±7**38±5**52±8**157±15**21±5**32±7**39±10**145±13**

2.2 脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量變化情況

正常組大鼠與假手術(shù)組大鼠脊髓背角內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組相比，骨癌痛組接種腫瘤細(xì)胞后第4天開始不僅大鼠造模側(cè)脊髓背角內(nèi)的GFAP免疫陽性細(xì)胞數(shù)量增加，即星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加（表1），而且星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了變化（圖2）。在正常組及假手術(shù)組脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起呈網(wǎng)狀分布，排列較整齊，胞體的形態(tài)不清晰，而接種腫瘤細(xì)胞后，骨癌痛組星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起逐漸變得粗大，相互重疊，胞體形態(tài)清晰可見，對側(cè)也有相同的趨勢。

2.3 機械性痛閾值變化

采用大鼠造模前von Frey細(xì)絲測定機械性痛閾值作為基礎(chǔ)值，造模后第2天開始隔天測定大鼠機械性痛閾值。結(jié)果顯示，在造模側(cè)，與正常組大鼠相比，骨癌痛組和假手術(shù)組在術(shù)后第2天機械性痛閾值開始下降，但在術(shù)后第6天以后，假手術(shù)組與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而骨癌痛組機械性痛閾持續(xù)下降，接種后第16天降至觀察中的最低點。在對側(cè)，骨癌痛組和假手術(shù)組術(shù)后機械性痛閾值也出現(xiàn)降低，從術(shù)后第6天開始，假手術(shù)組恢復(fù)到正常水平，而骨癌痛組機械性痛閾同正常大鼠相比仍具有顯著性差異（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

本研究所應(yīng)用的脛骨癌痛模型是比較成功的骨癌痛模型，被國內(nèi)外文獻(xiàn)廣泛報道[4]，并首次在這一模型上發(fā)現(xiàn)了血脊髓屏障的破壞。在正常情況下，內(nèi)生白蛋白不能透過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入脊髓，但是在一些病理狀態(tài)下，如缺血疼痛造成的屏障破壞致使在脊髓內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)白蛋白免疫陽性細(xì)胞。一些文獻(xiàn)報道，血脊髓屏障的破壞和白蛋白的漏出具有很好的相關(guān)性[6]。因此，筆者應(yīng)用了免疫組織化學(xué)方法檢測了脊髓背角內(nèi)的白蛋白免疫陽性細(xì)胞，以判斷血脊髓屏障通透性的變化。

研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脛骨癌痛模型造模后的第4天脊髓背角內(nèi)就出現(xiàn)了白蛋白免疫陽性細(xì)胞和較彌散的顆粒，陽性細(xì)胞具有神經(jīng)元形態(tài)。腦及脊髓外傷可導(dǎo)致神經(jīng)元對內(nèi)生蛋白的攝取增加。在缺血模型中白蛋白免疫陽性的神經(jīng)元及其細(xì)胞核則代表了死亡的細(xì)胞[6]。這也說明了在造模后第16天出現(xiàn)的白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加及輪廓更加清晰，有可能是神經(jīng)細(xì)胞的大量死亡所引起的。

在這一模型中，筆者認(rèn)為造成血脊髓屏障破壞的原因部分可能是脛骨癌痛。有文獻(xiàn)報道，在炎性痛及神經(jīng)痛中存在血腦及血脊髓屏障的破壞[6-9]。而事先應(yīng)用局麻藥利多卡因或者布比卡因抑制疼痛可阻止屏障的破壞[3，7]。這說明是由于疼痛刺激引起了屏障的破壞。疼痛引起屏障的破壞主要是通過影響血腦及血脊髓屏障的結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是組成血腦及血脊髓屏障的重要部分。緊密連接主要由三種結(jié)合膜蛋白質(zhì)組成，即claudin-5、occludin、JAM（連接黏附分子），還有一些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的輔助蛋白，如ZO-1等。胞質(zhì)內(nèi)的輔助蛋白能將膜蛋白連接到細(xì)胞骨架蛋白Actin上，維持內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及功能的完整[10]。在神經(jīng)痛模型中發(fā)現(xiàn)，ZO-1及occludin表達(dá)下調(diào)[2]。在炎性痛模型中，occludin 表達(dá)下降[8]，occludin 低聚合物解聚[11]，ZO-1、Actin、claudin-5表達(dá)增加[3]。這也表明疼痛模型不同，對緊密連接的影響也不大相同。緊密連接的組成和功能也能被許多信號分子調(diào)節(jié)，如cAMP、Ca2+、G蛋白、磷脂酶C、甘油二酯、小G蛋白、蛋白激酶C等[8]，還有一個重要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞質(zhì)膜微囊，內(nèi)皮細(xì)胞通過胞吞胞吐可以從血液轉(zhuǎn)運物質(zhì)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)。細(xì)胞質(zhì)膜微囊的支架蛋白Caveolin-1是其重要組成部分[12]，在部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型中，Caveolin-1的減少在CMP-1的存在下可以使得緊密連接的輔助蛋白遭到破壞，從而也影響了屏障的完整[13]。另外，許多急、慢性痛的模型中，循環(huán)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有各種炎性介質(zhì)，在疼痛的發(fā)生及發(fā)展中起著重要的作用，同時這些炎性介質(zhì)也調(diào)節(jié)了血腦及血脊髓屏障的開放。ICAM-1是免疫球蛋白表面受體，可以改變內(nèi)皮細(xì)胞的骨架形態(tài)，導(dǎo)致循環(huán)中的免疫細(xì)胞的浸潤[14]。由激活的神經(jīng)元分泌的MCP-1能夠通過內(nèi)皮細(xì)胞上的CCR2開放屏障，促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤[15]。由免疫細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子IL-1β也可以促進(jìn)屏障的開放，而抗炎因子IL-10可以促進(jìn)屏障的恢復(fù)[2]。TGF-1β激活內(nèi)皮細(xì)胞表面受體AKL-5，通過下游Smad2/3信號通路調(diào)節(jié)屏障的通透性[2，16]。

本研究檢測的脊髓背角正是疼痛調(diào)節(jié)的重要部位。在這一模型中也發(fā)現(xiàn)了脊髓背角內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的雙側(cè)激活。大量的文獻(xiàn)證明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的維持階段起著重要的作用[17]。同時星形膠質(zhì)細(xì)胞也是血脊髓屏障的重要組成部分，其數(shù)量及形態(tài)的變化就有可能會影響到血脊髓屏障的通透性。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過多條信號通路與內(nèi)皮細(xì)胞交流，其共同培養(yǎng)可以促進(jìn)緊密連接的形成，星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的多種物質(zhì)，如谷氨酸、天門冬氨酸、牛磺酸、內(nèi)皮素-1、ATP、NO、MIP-2、TNF-α 等都會對屏障產(chǎn)生影響[10]。在筆者的研究中，血脊髓屏障的破壞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生同時出現(xiàn)，但是變化的時程并不一致。筆者推測后期星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變可能更進(jìn)一步地增加了其通透性，強烈的疼痛造成了神經(jīng)細(xì)胞功能的改變，對蛋白攝取增加，使蛋白沉積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，這些都造成了最后白蛋白免疫陽性細(xì)胞數(shù)量增加及染色加深。另外，在背根神經(jīng)切斷的神經(jīng)痛模型中，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生肥大與血脊髓屏障破壞的時程相一致[6]。本研究的發(fā)現(xiàn)也可能說明了癌性疼痛和神經(jīng)痛在機制方面存在著不同。

目前，對于疼痛引起血腦及血脊髓屏障破壞機制方面的研究還較少。缺乏研究血脊髓屏障的工具藥物阻礙了對其相關(guān)機制進(jìn)一步地探索。隨著研究方法及藥物的完善，不斷揭示的相關(guān)機制可能為疼痛的治療提供新的方法。

[1]Sharma HS.Pathophysiology of blood-spinal cord barrier in traumatic injury and repai[J].Curr Pharm Des，2005，11（11）：1353-1389.

[2]Echeverry S，Shi XQ，Rivest S，et al.Peripheral nerve injury alters blood-spinal cord barrier functional and molecular integrity through a selective inflammatory pathway[J].J Neurosci，2011，31（30）：10819-10828.

[3]Campos CR，Ocheltree SM，Hom S，et al.Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier[J].Brain Res，2008，1221：6-13.

[4]Mao-Ying QL，Zhao J，Dong ZQ，et al.A rat model of bone cancer pain induced by intra-tibia inoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，345（4）：1292-1298.

[5]Dong Y，Mao-Ying QL，Chen JW，et al.Involvement of EphB1 receptor/ephrinB1 ligand in bone cancer pain[J].Neurosci Lett，2011，496（3）：163-167.

[6]Gordh T，Chu H，Sharma HS.Spinal nerve lesion alters blood-spinal cord barrier function and activates astrocytes in the rat[J].Pain，2006，124（1-2）：211-221.

[7]Beggs S，Liu XJ，Kwan C，et al.Peripheral nerve injury and TRPV1-expressing primary afferent C-fibers cause opening of the bloodbrain barrier[J].Mol Pain，2010，6：74.

[8]Huber JD，Witt KA，Hom S，et al.Inflammatory pain alters bloodbrain barrier permeability and tight junctional protein expression[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280（3）：1241-1248.

[9]Brooks TA，Hawkins BT，Huber JD，et al.Chronic inflammatory pain leads to increased blood-brain barrier permeability and tight junction protein alterations[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（2）：738-743.

[10]Ballabh P，Braun A，Nedergaard M.The blood-brain barrier： an overview：structure，regulation，and clinical implications[J].Neurobiol Dis，2004，16（1）：1-13.

[11]Mccaffrey G，Seelbach MJ，Staatz WD，et al.Occludin oligomeric assembly at tight junctions of the blood-brain barrier is disrupted by peripheral inflammatory hyperalgesia [J].J Neurochem，2008，106（6）：2395-2409.

[12]Nag S，Manias JL，Stewart DJ.Expression of endothelial phosphorylated caveolin-1 is increased in brain injury [J].Neuropathol Appl Neurobiol，2009，35（4）：417-426.

[13]Song L，Ge S，Pachter JS.Caveolin-1 regulates expression of junction-associated proteins in brain microvascular endothelial cells[J].Blood，2007，109（4）：1515-1523.

[14]Turowski P，Adamson P，Greenwood J.Pharmacological targeting of ICAM-1 signaling in brain endothelial cells：potential for treating neuroinflammation[J].Cell Mol Neurobiol，2005，25（1）：153-170.

[15]Ge S，Song L，Serwanski DR，et al.Transcellular transport of CCL2 across brain microvascular endothelial cells [J].J Neurochem，2008，104（5）：1219-1232.

[16]Ronaldson PT，Demarco KM，Sanchez-Covarrubias L，et al.Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain[J].J Cereb Blood Flow Metab，2009，29（6）：1084-1098.

[17]Cao H，Zhang YQ.Spinal glial activation contributes to pathological pain states[J].Neurosci Biobehav Rev，2008，32（5）：972-983.