慢性纖維包塊型胰腺炎與胰腺導管腺癌癌旁組織的病理學及免疫組化特征

史敏 張晶 陳穎 趙晨燕 劉清華 王洋 高莉 朱明華

·論著·

慢性纖維包塊型胰腺炎與胰腺導管腺癌癌旁組織的病理學及免疫組化特征

史敏 張晶 陳穎 趙晨燕 劉清華 王洋 高莉 朱明華

目的比較慢性纖維包塊型胰腺炎(FMCP)及胰腺導管腺癌(PDAC)癌旁組織基本病理變化特征，試從間質微環境角度探討FMCP在促進PDAC發生、發展中的可能作用。方法對48例FMCP及62例PDAC的癌旁組織HE切片進行鏡下觀察比較，觀察內容包括導管上皮內瘤變(PanIN)、導管復合體形成(TC)、纖維結締組織增生、炎細胞浸潤及神經炎等病理變化。免疫組化法檢測神經纖維增生和微血管形成狀況。結果FMCP及PDAC癌旁組織中PanIN的發生率分別為97.9%(47/48)和91.4%(53/58)，其中PanIN-3在PDAC癌旁組織內發生率為20.8%，顯著高于FMCP的4.3%(P=0.031)；TC的發生率分別為58.3%(28/48)和65.0%(40/62)，差異無統計學意義(P=0.508)。FMCP促纖維結締組織增生程度重于PDAC癌旁組織，以中、重度為主(P=0.037)。兩種組織的炎細胞浸潤程度差異無統計學意義(P=0.754)；神經炎發生率分別為81.3%和66.1%，差異亦無統計學意義(P=0.077)。FMCP及PDAC癌旁組織內細小無髓神經纖維數目明顯增加，發生率分別為68.8%(33/48)和63.3%(38/60)，200倍視野下計數分別為(12.08±3.72)根和(11.14±4.70)根，差異無統計學意義(P=0.537)；微血管密度(MVD)分別為(39.69±22.88)個和(44.89±16.83)個，差異亦無統計學意義(P=0.605)。結論FMCP及PDAC癌旁呈現較為相似的病理變化，提示FMCP在PDAC發生、發展過程中提供了可能的微環境，FMCP可能是重要的PDAC癌前病變。

胰腺腫瘤； 胰腺炎，慢性； 病理學； 免疫組織化學； 腫瘤微環境

目前炎癥在腫瘤發生、發展中的作用引起研究者的廣泛關注。事實上，早在1863年，德國學者Virchow就已提出“腫瘤起源于慢性炎癥”的假說[1]。此后，多項流行病學及相關研究結果相繼證實，多種腫瘤的發生、發展與慢性炎癥密切相關。如Barrett食管及食管癌、幽門螺桿菌感染相關性胃炎與胃癌、炎癥性腸病與結直腸癌及病毒性肝炎與肝細胞癌等[2]。近年來，臨床及流行病學領域研究表明，慢性胰腺炎(CP)在胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)發生、發展過程中可能扮演了重要角色[3]。因此，深入研究CP在PDAC發生、發展中的作用機制具有重要意義。本研究對以纖維結締組織增生為主的慢性纖維包塊型胰腺炎(fibrous mass-forming chronic pancreatitis, FMCP)與PDAC癌旁組織的形態學進行比較，試圖從間質微環境角度探討FMCP在促進PDAC發生、發展中的可能作用。

材料與方法

一、標本

選取長海醫院2004年至2007年間48例經手術切除并病理證實的FMCP存檔石蠟包埋標本和62例經手術切除并病理確診的PDAC存檔石蠟包埋標本。所有研究標本均經長海醫院倫理委員會批準。48例FMCP中男性42例，女性6例，年齡18～73歲，平均(47±14)歲，中位年齡47歲。62例PDAC中男性36例，女性26例，年齡29～80歲，平均(60±12)歲，中位年齡62歲。所有石蠟包埋標本行4 μm及3 μm厚連續切片，HE染色或免疫組織化學染色，光鏡下讀片。PDAC觀察區域以癌旁組織為主。FMCP及PDAC兩組切片均選擇鏡下小葉結構完整，且導管及腺泡無明顯病理改變的區域作為正常對照。

二、HE染色切片的光鏡觀察

1．中小導管及腺泡的病理改變：包括導管上皮內瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)及導管復合體(tubular complexes, TC)的形成。PanIN分級參照2000年WHO分級標準，一張切片中若同時存在幾種PanlN結構，則以級別高者作為該例的PanIN病理診斷。導管復合體形成的病理特點參考文獻[4]，表現為小葉內出現集中分布的導管樣結構取代原有的腺泡組織，單層或扁平的導管樣細胞排列成管狀，無明顯萎縮跡象，有時伴有黏蛋白分泌，部分管周可見不同程度纖維結締組織增生。

2．纖維結締組織增生程度分級：分為輕度、中度及重度3個級別。輕度：胰腺小葉結構尚存，間隔增寬，少量纖維組織增生；中度：胰腺小葉萎縮，部分尚存，間質內可見寬大致密的纖維組織增生；重度：胰腺小葉大部分萎縮消失，代之以大量寬大致密的纖維組織增生為背景，殘留胰島散在或聚集分布。

3．間質內炎細胞浸潤：按炎癥細胞的數量分為少量、中量及大量3個級別。每高倍視野炎細胞散在存在為少量，彌漫成片為大量，介于二者之間為中量。

4．神經纖維周圍炎細胞浸潤：以神經纖維周圍是否出現慢性炎細胞包繞神經的現象分為“有”或“無”。

三、免疫組織化學染色

采用PV9000試劑盒(美國GBI公司)行免疫組織化學染色，嚴格按試劑盒說明書操作。鼠抗人CD56單抗(北京中杉金橋公司)工作濃度1∶50，鼠抗人CD31單抗及鼠抗人細胞角蛋白 19(Cytokeratin 19，CK19)單抗(北京中杉金橋公司)工作濃度1∶100。最后DAB顯色，蘇木精襯染。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照，用非免疫血清代替一抗作陰性對照。

結果判定：CD56及CD31以胞膜、CK19以胞質呈黃色或出現棕黃色顆粒為陽性表達細胞。細小無髓神經纖維計數方法：先在40倍光鏡下確定CD56陽性染色最集中的區域，然后在200倍視野下取5個視野對陽性染色的細小神經纖維進行計數，取均值，<4根計為陰性，≥4根為陽性。微血管密度(microvessel density，MVD)計數方法：先在40倍光鏡下確定CD31陽性染色最集中的區域，然后在200倍視野下取5個視野對陽性染色的血管進行計數，取均值。微血管判定標準：凡染為棕黃色的單個或成叢的內皮細胞，不管成腔與否均視為單個微血管，凡管徑>8個紅細胞或有肌層的血管不予計數。

四、統計學處理

所有數據均使用SPSS11.5軟件進行統計學處理。雙向有序資料采用χ2檢驗，Mann-Whitney Test進行強度比較，細小無髓神經纖維及MVD計數結果采用Dunnett′sC法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、FMCP與PDAC癌旁組織的形態學觀察

1．組織形態學表現及PanIN發生率：PDAC癌旁組織鏡下常呈現出較為典型的進展期及終末期FMCP樣的病理改變，其主要表現包括中小導管上皮顯著增生形成PanIN，小葉腺泡不同程度萎縮，導管復合體形成，間質內大量纖維結締組織增生，可累及小葉周圍并將小葉實質分割成不規則結節狀，同時伴有不同程度的炎細胞浸潤、胰島聚集等(圖1a、1b)。

PanIN典型病理表現為中小導管上皮顯著增生，出現組織及細胞形態的異常，如立方上皮被柱狀上皮取代且細胞質內產生大量黏液，細胞核增大、排列擁擠，染色質增粗，核分裂增多。FMCP及PDAC癌旁組織中的PanIN發生率分別為97.9%(47/48)和91.4%(53/58)，其中PanIN-3在PDAC癌旁組織的發生率顯著高于FMCP(P=0.031，表1，圖2)。

2．纖維結締組織增生及炎細胞浸潤程度：FMCP和PDAC癌旁組織均伴有不同程度的纖維結締組織增生及炎細胞浸潤，FMCP的纖維結締組織增生程度重于PDAC癌旁組織，以中、重度為主(P=0.037)；兩者炎細胞浸潤程度的差異無統計學意義(P=0.754，表1)。 另外，在FMCP及PDAC癌旁組織內發生PanIN病變以及部分TC形成的小導管周圍亦可看到成纖維細胞及纖維膠原增生、管壁增厚的現象。

圖1PDAC癌旁組織(左)與FMCP組織(右)病理改變(a、b)、PanIN灶(c、d)、腺泡導管組織轉化(e、f)(HE ×40，×100，×200)

3．神經纖維周圍炎癥：FMCP及PDAC癌旁組織內的神經纖維周圍常有以淋巴細胞為主的單個核細胞浸潤，嚴重時單個核細胞形成套樣結構，包繞在神經外膜周圍。兩者發生率的差異無統計學意義(P=0.077，表1，圖2)。

二、免疫組織化學檢測結果

1．TC的形成：CK19定位于PDAC癌性導管上皮及癌旁非癌性導管上皮，包括TC導管上皮(圖3)。FMCP及PDAC癌旁組織的TC發生率分別58.3%(28/48)和65.0%(40/62)，兩者間差異無統計學意義(P=0.508)。

2．無髓神經纖維數量：CD56定位于神經纖維，無髓神經纖維分布于小葉間或腺泡間(圖4)。FMCP及PDAC癌旁組織內均分布有數量不等的外周神經纖維，與相應的正常組織比較，數目顯著增多。FMCP及PDAC癌旁組織內的無髓神經纖維陽性率分別為68.8%(33/48)和63.3%(38/60)，差異無統計學意義(P=0.077)；在200倍視野下兩種組織無髓神經纖維數量分別為(12.08±3.72)、(11.14±4.70)根，差異亦無統計學意義(P=0.537)。

表1 FMCP及PDAC癌旁組織主要病理改變的比較

圖2FMCP(a)和PDAC(b、c、d)癌旁組織神經纖維周圍炎癥及嗜神經浸潤(HE ×100,×200)

3．MVD：CD31定位于大部分毛細微血管和單個內皮細胞(圖5)。FMCP及PDAC癌旁組織內均可見血管分支紊亂、管腔不規則，內皮細胞單個及成簇排列。200倍視野下FMCP及PDAC癌旁組織的MVD分別為(39.69±22.88)、(44.89±16.83)個，兩者間差異無統計學意義(P=0.605)。

圖3FMCP(a)和PDAC癌旁組織(b)的導管組織轉化(免疫組化， ×200)

圖4FMCP(a)、PDAC癌旁組織(b)的CD56表達及FMCP(c、d)的細小無髓神經和導管旁神經纖維(HE ×40,×200)

圖5PDAC癌旁組織(a)和FMCP組織(b)內血管分布及FMCP的神經炎(c)和導管周圍血管增生(d，×200)

討 論

CP與PDAC的發生、發展有密切的相關性。1993年Lowenfels等[5]對歐美6個國家2015例CP患者追蹤隨訪，平均隨訪7.4 ～6.2年，結果檢出PDAC患者56例。隨訪2年以上的患者，胰腺癌的累積發生率穩步上升，在CP診斷10、20年后，胰腺癌的累計發生率分別為1.8%和4.0%，因此，CP被認為可能是PDAC的癌前病變。

CP向PDAC發展的過程中，PanIN被認為是重要的形態學改變。1999年世界胰腺癌研討會正式對這一病理形態進行定義[6]，并對其分級和診斷標準做了確認，目前將PanIN界定為PDAC的癌前病變。根據文獻報道[7]，PanIN發生率在正常胰腺組織、CP組織及PDAC癌旁組織中逐漸增高，尤以高級別PanIN更為顯著。PanIN-3級僅見于PDAC癌旁組織和CP組織中，且癌旁組織發生率高于CP。分子遺傳學則更從多方面證實PanIN可演變發展為導管內癌及浸潤性導管癌[8]。本研究結果顯示，PanIN發生率在FMCP及PDAC癌旁中均高于相應的正常胰腺組織，且PanIN-3級在癌旁組織發生率明顯高于FMCP，與文獻前期報道一致。Guerra等[9]曾在K-ras基因突變小鼠模型中發現，當K-ras基因突變事件單獨存在時，不能引發PanIN病理改變，而同時伴隨有慢性炎癥時則可以出現PanIN改變，并且進一步發展為胰腺癌。因此認為胰腺癌是在遺傳及環境因素的共同作用下發生的，而CP在此模型中則可能為K-ras基因的突變提供了有利的微環境。

在慢性炎癥的刺激下組織可以反復再生，亦可能出現組織轉化。在CP及PDAC癌旁組織的病變區域，常可見到TC的形成。對于這一病變，早在上個世紀80年代就已報道過。1998年Cylwik等[10]研究發現，70例CP組織標本中，有30.0%的病例胰腺腺泡發生導管組織轉化。本研究結果顯示，TC在FMCP及PDAC癌旁組織內的發生率無顯著差異。對TC形成的起源目前尚存在較大爭議。有學者提出，幾乎胰腺所有的細胞成分都可能成為TC的起源細胞。TC形成的機制亦有增生、再生以及組織轉化等多種解釋。在建立PDAC體內模型的過程中，研究者發現TC出現在胰腺早期病理改變中，并能在致癌物持續作用的情況下逐漸發生惡性轉化[11]，因此認為TC可能是比PanIN更早的胰腺癌早期事件。

促纖維結締組織增生是FMCP和PDAC顯著的病理學特征。Imamura等[12]通過定性及定量分析，證明在PDAC癌內和癌旁CP樣病變區以及CP中增生的膠原纖維，其數量及類型是相似的。通過對PDAC和CP間質的基因表達譜分析得出的相似結果則更證實這一觀點[13]。本研究結果顯示，FMCP促纖維結締組織增生的程度重于PDAC癌旁，考慮可能是腫瘤細胞分泌基質金屬蛋白酶，降解膠原纖維所致。另外，本研究還發現在FMCP及癌旁發生PanIN病變的小導管周圍纖維組織增生，管壁增厚。這一現象被EspositoI等[14]認為是膠原纖維在導管發生PanIN病變并向PDAC演變中逐漸累積的過程。

在FMCP及PDAC癌旁組織的間質中常存在顯著的炎細胞浸潤，炎細胞的存在有利于腫瘤的生長及擴散[15]。本結果顯示，FMCP及PDAC癌旁組織中炎細胞的分布及程度無明顯差異，提示從CP到PDAC可能是一個連續的過程，炎癥在其中均發揮了重要作用。

神經炎是CP組織常見的病理現象，與CP患者腹痛癥狀密切相關。PDAC癌旁組織中亦存在神經炎。PDAC內已發生癌組織浸潤的神經纖維常突出且不規則分布于纖維組織中，周圍浸潤的單個核細胞極為稀少甚至消失，與癌旁尚未發生癌組織侵襲但伴有單個核細胞浸潤的神經纖維形成鮮明對比。如何解釋這一現象尚待深入研究。

血管生成已被普遍認為與腫瘤的多種生物學行為密切相關。PDAC的MVD明顯高于正常胰腺組織[16-17]，在CP中亦有報道[18]。本結果顯示，FMCP及PDAC癌旁組織的MVD無顯著差異。

總之，FMCP在PDAC發生、發展過程中提供了可能的微環境基礎，FMCP時聚集的免疫炎細胞、激活的成纖維細胞及沉積的膠原纖維、增生的無髓神經以及新生的血管內皮等同樣存在于PDAC的微環境中，因此，FMCP可能為重要的PDAC癌前病變，重視FMCP的診斷和治療對PDAC的預防具有極為重要的意義。

[1] Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet, 2001, 357: 539-545.

[2] Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature, 2002, 420: 860-867.

[3] Greer JB,Whitcomb DC.Inflammation and pancreatic cancer:an evidence-based review.Curr Opin Pharmacol,2009,9:411-418.

[4] Strobel O, Dor Y, Alsina J, et al. In vivo lineage tracing defines the role of acinar-to-ductal transdifferentiation in inflammatory ductal metaplasia. Gastroenterology, 2007,133: 1999-2009.

[5] Farrow B, Evers BM. Inflammation and the development of pancreatic cancer. Surg Oncol, 2002, 10: 153-169.

[6] Hruban RH, Adsay NV, Albores-Saavedra, et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am J Surg Pathol, 2001, 25: 579-586.

[7] Andea A, Sarkar F, Adsay VN. Clinicopathological correlates of pancreatic intraepithelial neoplasia: a comparative analysis of 82 cases with and 152 cases without pancreatic ductal adenocarcinoma. Mod Pathol, 2003, 16: 996-1006.

[8] Hruban RH, Wilentz RE, Kern SE. Genetic progression in the pancreatic ducts. Am J Pathol, 2000, 156: 1821-1825.

[9] Guerra C, Schuhmacher AJ, Caamero M, et al. Chronic pancreatitis is essential for induction of pancreatic ductal adenocarcinoma by K-Ras oncogenes in adult mice. Cancer Cell, 2007, 11: 291-302.

[10] Cylwik B, Nowak HF, Puchalski Z,et al. Epithelial anomalies in chronic pancreatitis as a risk factor of pancreatic cancer. Hepatogastroenterology.1998, 45:528-532.

[11] Bockman DE, Guo J, Büchler P, et al. Origin and development of the precursor lesions in experimental pancreatic cancer in rats. Lab Invest, 2003, 83: 853-859.

[12] Imamura T, Iguchi H, Manabe T,et al. Quantitative analysis of collagen and collagen subtypes I, III, and V in human pancreatic cancer, tumor-associated chronic pancreatitis, and alcoholic chronic pancreatitis. Pancreas, 1995, 11: 357-364.

[13] Binkley CE, Zhang L, Greenson JK, et al. The molecular basis of pancreatic fibrosis: common stromal gene expression in chronic pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma. Pancreas, 2004, 29: 254-263.

[14] Esposito I, Penzel R, Chaib-Harrireche M, et al. Tenascin C and annexin II expression in the process of pancreatic carcinogenesis. J Pathol, 2006, 8: 673-685.

[15] Bingle L, Brown NJ, Lewis CE. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies. J Pathol, 2002, 196: 254-265.

[16] Couvelard A, O′Toole D, Leek R, et al. Expression of hypoxia-inducible factors is correlated with the presence of a fibrotic focus and angiogenesis in pancreatic ductal adenocarcinomas. Histopathology, 2005, 46: 668-676.

[17] Giannopoulos G, Kavantzas N, Parasi A, et al. Morphometric microvascular characteristics in the prognosis of pancreatic and ampullary carcinoma. Pancreas. 2007, 35: 47-52.

[18] 程祝忠，許國輝，黃娟，等.胰腺癌CT灌注成像表現及其生物學相關性研究.四川大學學報：醫學版，2009,40:521-524.

Pathologicalandimmunohistochemicalcharacteristicsoffibrousmass-formingchronicpancreatitisandpancreaticductaladenocarcinomaadjacenttissues

SHIMin,ZHANGJing,CHENYing,ZHAOChen-yan,LIUQing-hua,WANGYang,GAOLi,ZHUMing-hua.

DepartmentofPathology,GeneralHospitalofLanzhouMilitaryRegion,Lanzhou730000,China

ZHUMing-hua,Email:mhzhu2000@hotmail.com

ObjectiveTo compare the pathological characteristics of fibrous mass-forming chronic pancreatitis (FMCP) with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) adjacent tissues, and investigate the possible role of FMCP in the development and promotion of PDAC.MethodsThe HE sections of 48 cases of FMCP and 62 cases of PDAC adjacent tissues were observed and compared, and the observed pathology included pancreatic ductal intraepithelial neoplasia (PanIN), tubular complexes formation (TC), fibrous connective tissue hyperplasia, inflammatory cell infiltration and neuritis. Immunohistochemical method was used to detect nerve fiber hyperplasia and angiogenesis situation.ResultsThe incidence of PanIN in FMCP and PDAC adjacent tissues was 97.9%(47/48) and 91.4%(53/58). The incidence of PanIN-3 in the PDAC adjacent tissues was 20.8%, which was significantly higher than that of FMCP (4.3%,P=0.031). The incidence of TC in FMCP and PDAC adjacent tissues was 58.3%(28/48) and 65.0%(40/62), respectively, the difference was not statistically significant (P=0.508). The promotion of fibrous connective tissue hyperplasia in FMCP was more severe than that in the PDAC adjacent tissues, which was mainly moderate to severe (P=0.037). The difference between the two groups in terms of degree of inflammatory cell infiltration was not significant (P=0.754), the incidence of neuritis in FMCP and PDAC adjacent tissues was 81.3% and 66.1%, respectively, there was no significant difference (P=0.077). The number of small unmyelinated nerve fibers was obviously increased in the FMCP (68.8%, 33/48) and PDAC adjacent tissues (63.3%, 38/60), and the count number under 200 magnification was 12.08±3.72 and 11.14±4.70, and there was no significant difference (P=0.537). The microvessel density (MVD) of FMCP and PDAC adjacent tissues was 39.69±22.88 and 44.89±16.83, and there was no significant differences (P=0.605).ConclusionsThe pathological changes of FMCP and PDAC adjacent tissues are similar, which suggests the possible function of FMCP′s microenvironment in PDAC development. FMCP may be an important precancerous lesion of PDAC.

Pancreatic neoplasms; Pancreatitis chronic; Pathology; Immunohistochemistry; Tumor micro-environment

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.011

國家自然科學基金(81172310)

730000 蘭州，蘭州軍區總醫院病理科(史敏)；上海第二軍醫大學附屬長海醫院病理科(張晶、陳穎、趙晨燕、劉清華、王洋、高莉、朱明華)

共同第一作者：張晶

朱明華，Email：mhzhu2000@hotmail.com

2013-04-03)

(本文編輯：屠振興)