急性胰腺炎中的損傷相關分子模式

羅雙靈 孫維佳

·綜述與講座·

急性胰腺炎中的損傷相關分子模式

羅雙靈 孫維佳

急性胰腺炎 (acute pancreatitis, AP)是多種病因引起胰酶激活，以胰腺局部炎癥反應為主要特征， 伴或不伴有其他器官功能改變的疾病[1]。其初始階段的局部炎癥反應已被證實了是由胰腺腺泡細胞的損傷及壞死介導的[2]。細胞損傷后釋放的物質被稱為損傷相關分子模式(Damage associated molecular pattern, DAMPs)。近年來越來越多的證據證明壞死的胰腺腺泡細胞釋放的DAMPs介導的炎癥反應是決定胰腺損傷及疾病嚴重程度的關鍵因素[3]。本文就急性胰腺炎中的DAMPs作一綜述。

一、DAMPs及受體

機體免疫系統分為固有免疫系統及獲得性免疫系統。獲得性免疫是由機體后天形成，通過B淋巴細胞及T淋巴細胞高度特異性識別病原體表面分子來清除病原體。固有免疫由巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及肥大細胞等通過細胞表面的模式識別受體(pattern-recognition receptor， PRRs)識別一些病原體共有的結構域，即病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)來實施對病原體的清除[4]。近年來已經證實了免疫細胞表面的PRRs也可以被自身分子模式所激活，這些自身分子模式一般存在于細胞內，在健康機體中不會引起免疫反應。當機體受到創傷、炎癥等應激狀況影響時，這些自身分子模式會由損傷的細胞釋放至血液中激活相應的PRRs而引起相應的炎癥反應，因此這些自身分子被稱為損傷相關分子模式[5]。目前已知的DAMPs有高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、熱休克蛋白(heat-shock proteins, HSPs)、透明質酸、S100蛋白、C3a、C4a、基因組DNA、RNA、尿酸、硫酸肝素及ATP等[6]。與這些DAMPs相對應的受體有Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、P2X7受體、Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)等[7-9]。DAMPs與受體結合后可激活MAPKs、NF-κB及PI3K/AKT等信號通路，從而可引起炎癥反應或調節細胞死亡。目前發現在敗血癥、關節炎、動脈粥樣硬化、系統性紅斑狼瘡、克羅恩病及癌癥中都存在外周血DAMPs水平的升高[10]。

在炎癥反應過程中， DAMPs與相應的PRRs結合后引起炎性因子的釋放至少需要激活兩條信號通路。通路1是HGMB1、HSPs、S100及基因組DNA等DAMPs通過細胞膜或內膜上的TLR4、TLR9、RAGE及TREM1受體誘發前炎性因子如前白介素1β(IL-1β)、前白介素18(IL-18)的產生。通路2是由ATP、尿酸、膽固醇結晶等DAMPs通過膜上的P2X7受體、Nod樣受體等激活一種稱為NLRP3炎性體(inflammasome)的胞質復合物，這種炎性體由 Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3, NLRP3)、凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)及caspase-1組成[11]，可以調節半胱氨酸激酶1(caspase 1)的蛋白水解成熟，從而將前促炎因子如pro-IL-1β、pro-IL-18轉化為成熟的形式[3]。在這兩條信號通路中，NLRP3炎性體的活化是引起炎癥反應的關鍵因素，也是產生IL-1β的必要步驟。IL-1β異常增多的一些疾病大都與NLRP3炎性體的過度激活相關[12]。

二、DAMPs與急性胰腺炎

在AP病程進展過程中，炎性因子的過度激活及級聯放大效應發揮了重要作用，炎性反應的程度決定了疾病的嚴重程度及病死率[13]。目前研究發現許多DAMPs都參與了AP的炎癥放大過程，且發揮重要作用[3]。

1．HMGB1：HMGB1是一種重要的DAMP分子，它可以由壞死細胞被動釋放，也可以由巨噬細胞、NK細胞和成熟的樹突狀細胞主動分泌。HMGB1可刺激單核巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞等分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等前炎癥因子，還能誘導血管內皮細胞上內皮細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細胞間黏附分子1(VCAM-1)、E-選擇素的表達，進一步調節和放大炎癥反應；還促進內皮細胞釋放纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，打破生理的凝血和抗凝血平衡，在炎癥反應時的組織缺血壞死、血栓形成、彌散性血管內凝血的發生中發揮重要的作用[14]。HGMB1作用的受體較廣泛，如RAGE、TLR4、TREM1等，均可引起炎癥反應[10]。Yasuda等[15]報道，重癥急性胰腺炎(SAP)患者外周血中HMGB1水平明顯高于健康對照組，且與患者入院時的嚴重度評分(Glasgow評分及日本嚴重度評分)、總膽紅素、LDH及CRP呈正相關，但與患者性別、病因、胰腺壞死程度、Ranson評分、APACHEⅡ評分及淀粉酶水平無關，有器官功能障礙的患者HMGB1水平高于無器官功能障礙的患者，病死組高于存活組，表明HMGB1在SAP病程進展中發揮了關鍵作用，可作為早期預測AP病情進展及預后的重要指標。Kocsis等[16]比較了SAP與敗血癥患者外周血HMGB1水平，發現SAP患者HMGB1水平高于敗血癥患者，在感染性壞死性胰腺炎中表達水平最高，且與降鈣素原(PCT)水平呈正相關。但是作者在研究中同時發現，作為HMGB1主要受體RAGE的游離成分sRAGE的水平在SAP中與HMGB1呈負相關，而在敗血癥中則呈正相關，其原因不明，推測可能與減弱炎性循環中的反饋機制從而進一步加重AP中的炎癥反應有關。在壞死性胰腺炎的動物模型中，HMGB1在外周血及受累及的器官(胰腺、肝臟、肺、腎、回腸)中表達均升高，且與遠處器官受累程度呈正相關[17]。Luan等[18]在鼠的SAP模型中發現HMGB1參與了腸黏膜屏障受損過程，回腸黏膜組織上HMGB1表達在發病6 h開始升高，持續48 h以上，且與腸黏膜炎癥浸潤程度呈正相關。用丙酮酸乙酯抑制HMGB1的表達可以明顯降低腸黏膜炎癥的程度。Sawa等[19]也在急性壞死性胰腺炎動物模型中發現利用HMGB1的中和抗體可以減輕SAP嚴重程度及器官損傷，但是會增加腸道細菌易位及感染的風險。以上研究表明HMGB1可能更多地參與了SAP的炎癥放大及后期的器官損傷,早期拮抗或中和HMGB1可能成為減輕SAP嚴重程度及改善患者病死率的有效治療手段之一。

2．DNA：血液循環中的DNA在許多疾病中被用來作為無創性的診斷工具之一，如自身免疫性疾病、腫瘤、產前診斷等。然而近年來研究發現宿主細胞受損后釋放的雙鏈DNA片段也可以作為一種損傷相關分子模式，通過免疫激活TLR9而促進組織損傷。Oka等[20]在2012年4月份《自然》雜志上報道，動物實驗結果顯示由于高血壓等原因使心肌細胞內的線粒體受損后，導致無用的線粒體DNA蓄積，這會引發“過度”的免疫反應，受損的線粒體DNA蓄積后，蛋白質“TLR9”會發揮作用，激活免疫反應，引發心肌炎癥，嚴重者可導致心力衰竭。進一步研究發現，即使能分解線粒體DNA的酶無法發揮作用，只要投放能遏制“TLR9”的物質，那么小鼠即使出現高血壓等情況，也不會出現心肌炎引發的心力衰竭。另一項發表在Shock雜志上的研究表明，創傷性休克鼠血液中釋放的大量線粒體DNA激活Toll樣受體9，引起細胞因子釋放，可能是創傷引起全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的反應機制之一[21]。Walker等[22]也證實，給小鼠注射脂質體/DNA可通過激活Toll樣受體9而誘發SIRS。以上研究都表明損傷后所釋放的DNA可引起炎癥反應。Kocsis等[16]在SAP患者血清中發現DNA水平明顯升高，且與患者CT評分呈正相關，輕癥組及正常對照組之間無明顯差別。 Gornik等[23]用實時PCR法檢測30名AP患者入院后第1、4、7天外周血DNA水平，發現SAP患者入院后第1、4天血清DNA水平明顯高于輕癥患者，當入院第一天血清DNA≥0.118 ng/μL時，其對于AP嚴重程度的預測敏感性為100%，特異性為89.5%，ROC曲線下面積為0.97，陽性預測值為83.3%，陰性預測值為100%，甚至優于Ranson評分(≥3)、APACHE II評分(≥9)及CRP(≥97)，且血清DNA水平與胰腺壞死程度呈正相關，因此認為血清DNA可以作為早期預測AP嚴重程度的重要指標。 但Bagul等[24]卻得出相反的結果，SAP患者血清DNA水平較對照組明顯下降，且與胰腺壞死程度無相關性。幾項研究結果不一致可能的原因有：(1)檢測時間不一致，Bagul等檢測的時間相對較晚(平均為5 d)，DNA可能存在降解或被吞噬，而前兩者檢測時間較早(≤2 d)；(2)檢測對象不一致，Bagul等檢測對象為入院48 h內APACHEⅡ評分>8分的SAP患者，Gornik檢測的是所有入院的AP患者；(3)實驗方法，包括標本的處理、DNA提取及檢測方法，三項研究都不一致。所以AP患者外周血DNA水平與AP嚴重程度的相關性還需大樣本實驗研究。最近Hoque等[25]在AP小鼠模型中發現，建模后1 h外周血DNA水平即明顯升高，基因敲除DNA特異性受體TLR9及加入TLR9拮抗劑都可以明顯減輕AP的胰腺水腫、炎癥及壞死程度，認為TLR9拮抗劑對于AP具有潛在的治療效果。這些研究結果提示，DNA及受體TLR9是AP發病過程中炎癥反應的重要組成成分，尤其對于急性壞死性胰腺炎。AP發病早期外周血游離DNA水平可有效預測疾病的嚴重程度，可以作為早期檢測指標之一。

3．熱休克蛋白(HSPs)：HSPs是機體在受到環境中物理、化學、生物、精神等刺激時，尤其是在高溫狀態時釋放的一類高度保守的蛋白質，普遍存在于所有細菌、植物及哺乳動物的細胞。HSPs主要作為一種分子伴侶，參與新合成蛋白的折疊、蛋白質的細胞內變形和易位、蛋白質的復性及清除嚴重受損的蛋白質，從而發揮細胞保護功能。在AP中，胰腺細胞也會產生大量的熱休克蛋白，如HSP72[26]、HSP27[27]、HSP70[28]，發揮對胰腺腺泡細胞的保護作用。然而最近的研究發現、細胞內的HSP70釋放至細胞外環境后可以作為一種DAMP，激活免疫反應而促進炎癥因子釋放。Song等[29]研究發現，外源性給予AP鼠Hsp 70可加重AP的嚴重程度及胰腺外并發癥，如SIRS、胰源性肺損傷，而基因敲除TLR4后，外源性的HSP70則無此作用，提示外源性HSP70通過TLR4而引起SIRS反應，從而增加了胰腺及遠處器官的損傷。除了HSP70，目前尚無其他熱休克蛋白作為DAMPs的報道。

4．ATP、尿酸、膽固醇結晶等小分子：這些小分子物質可以由壞死的細胞釋放，也可以由機體本身血液循環中產生，它們的共同特點是都會通過各自的通路激活NLRP3炎性體。NLRP3炎性體已被證實在非感染性炎性疾病中發揮重要調節作用[12]。Hoque等[25]證實，NLRP3炎性體的三種成分NLRP3、ASC及Caspase 1均參與AP的損傷過程，敲除ATP分子的受體P2X7后可減輕AP的胰腺損傷及炎性反應。Duewell等[30]也證實Caspase 1是胰腺炎腺泡細胞死亡及炎性網絡中必需的成分，將其基因敲除后可明顯減輕這些反應。NLRP3炎性體所介導的效應在AP中主要是促進IL-1β及IL-18的釋放。IL-1β所介導的信號通路在動物實驗中被證明是AP損傷及遠處器官損傷所必須的[31-32]。有證據表明，IL-1β在胰腺炎損傷早期的無菌性炎癥反應過程中發揮重要作用。血清中IL-1β水平在AP發病24 h內迅速升高，且SAP患者的水平明顯高于MAP患者[33]。這些結果在動物模型中也得到了證實，胰腺內的IL-1β水平超過了血清中的水平，且血清中IL-1β高峰早于IL-6的高峰[34]。給予外源性IL-12，可在野生型鼠中誘導出急性水腫性胰腺炎模型，在肥胖鼠中可誘導出壞死性胰腺炎模型[35-36]。另有研究報道，IL-18似乎在胰腺炎過程中發揮了一定的保護作用，敲除IL-18基因后可導致更嚴重的胰腺損傷[37]。AP患者血清IL-18的水平與疾病嚴重程度相關，且腹水IL-18的濃度比血清水平高20倍[38-40]。以上研究結果表明DAMPs所介導的炎癥反應貫穿于AP整個發病過程。

三、總結

AP發病機制非常復雜，其中炎癥反應由局部擴散至全身引起全身炎癥反應綜合征是決定疾病嚴重程度及病死率的關鍵因素。以往我們常常強調炎性細胞及炎性因子在參與AP發病過程中的重要性，而忽略了引起這些炎性反應的刺激因素，如細胞受損后釋放的各種DAMPs，它們的持續存在是引起炎性反應放大及遠處器官損傷的重要原因。在正常機體中，細胞損傷后釋放的DAMPs會因氧化還原反應或吞噬反應而被清除，因而不會引起持續的炎性反應。而在AP中，由于存在氧化還原反應及吞噬功能的減弱，引起DAMPs持續累積，從而刺激炎性細胞釋放過多的炎性因子，其中的具體機制尚不清楚。從上述的研究中可以發現一些DAMPs在AP早期即可以很好地預測疾病的嚴重程度，將來有可能可作為臨床重要的檢測指標。

鑒于DAMPs在AP炎癥放大過程中發揮的重要作用，而且在實驗中應用DAMPs拮抗劑或基因敲除DAMPs受體可以明顯減輕AP的炎癥反應程度。所以我們有理由相信關于AP中DAMPs的研究將為臨床上治療AP提供新的思路及策略。

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2012-10-31)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.023

410008 湖南長沙，中南大學湘雅醫院普通外科

孫維佳，Email:sunweijia6@126.com