HGF、C-Met和VEGF在子宮癌中的表達及其臨床意義

尹華偉

·論著·

HGF、C-Met和VEGF在子宮癌中的表達及其臨床意義

尹華偉

目的檢測HGF、C-Met和VEGF蛋白在子宮癌中的表達情況，分析三者在子宮癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲等方面的作用，為判斷子宮癌的預(yù)后及基因靶向治療提供理論及實驗依據(jù)。方法選取我校附屬醫(yī)院2009年12月至2010年8月期間收集的子宮癌手術(shù)患者35例，取其癌組織標(biāo)本作為研究組；取35例子宮肌瘤患者的組織標(biāo)本為對照1組；同時選取35例門診手術(shù)患者中正常子宮組織標(biāo)本作為對照2組，對照檢測HGF、C-Met和VEGF蛋白的表達，比較它們在子宮癌組織、子宮肌瘤組織和正常組織中的表達情況。結(jié)果HGF在子宮癌中的陽性表達為71.43%(20/35)，顯著高于子宮肌瘤組8.57%(3/35)和正常子宮組2.86%(1/35)，P<0.01；C-Met在子宮癌中的陽性表達為51.43%(18/35)，顯著高于子宮肌瘤組織8.57%(3/35)和正常組織5.71%(2/35)，P<0.01；VEGF在35例正常組織中呈微弱表達或不表達，僅有1例有陽性表達，占百分比為2.86%，而在35例子宮癌組織中有29例為蛋白陽性表達(82.86%，P<0.01)，子宮肌瘤組織中VEGF蛋白的陽性表達率與正常組織無顯著性差異，P>0.05。結(jié)論HGF、C-Met和VEGF蛋白在子宮癌中的表達顯著上調(diào)，其過度表達可能為子宮癌的促發(fā)因素之一，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

子宮癌；肝細胞生長因子；肝細胞生長因子受體；血管內(nèi)皮生長因子

子宮癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，占婦科腫瘤的10%～20%，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計80年代全世界子宮癌每年新發(fā)病例為45.9萬，而中國則為13.15萬，約占新發(fā)病例總數(shù)的1/3。而且，近年來世界各國資料均顯示子宮癌有年輕化和子宮頸腺癌發(fā)病率上升的趨勢。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是近年來國內(nèi)外研究的熱門課題，尤其是多種因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管再生中的作用日益受到重視。大量研究證實惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移涉及到多基因、多因素及多分子水平的過程，是一系列復(fù)雜的級聯(lián)式反應(yīng)[1]。國外研究表明，在腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)發(fā)揮了非常重要的作用。HGF是由間質(zhì)細胞分泌的一種多效性生長因子，其生物活性由單一受體C-Met 蛋白所介導(dǎo)，C-Met表達于多種上皮細胞上，兩者結(jié)合后，在調(diào)控組織和血管再生、胚胎發(fā)育以及損傷修復(fù)等過程中有重要作用[2,3]。并且HGF/C-Met參與多種細胞因子的調(diào)控，血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)即是其中之一。腫瘤血管生成有多種調(diào)控因子，VEGF是高度特異的促血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，并且是目前已知的作用最強的一種促血管生長因子[4]， VEGF表達水平高低反映了腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷徙和血管構(gòu)建的水平。HGF可通過3-磷脂酰肌醇激酶途徑誘導(dǎo)VEGF的表達和分泌，從而促進腫瘤血管的形成[5]。目前國內(nèi)外尚無HGF、C-Met、VEGF和子宮癌關(guān)系的研究和報道，為了解HGF、C-Met和VEGF與子宮癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，本研究采用免疫組織化學(xué)方法(PV二步法)檢測HGF、C-Met和VEGF蛋白在子宮癌中的表達情況并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集35例我校附屬醫(yī)院2009年12月至2010年8月期間收治的子宮癌患者行根治性手術(shù)后所留取的標(biāo)本，所有患者術(shù)前6個月內(nèi)均未使用過激素治療，未經(jīng)化療和放射治療，也無其他嚴(yán)重的內(nèi)外科疾病。均經(jīng)病理檢查確診，有詳細的病理資料和臨床記錄。每一例組織離體后迅速用生理鹽水沖洗掉血跡，用無菌手術(shù)刀在腫瘤中心部位切取癌組織，經(jīng)復(fù)習(xí)HE切片，再次光鏡診斷后，用10%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，5 μm厚切片。另取35例同時間內(nèi)收治的子宮肌瘤患者的組織標(biāo)本為對照1組，35例門診手術(shù)患者中正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本為對照2組，同樣制備石蠟切片，收起備用。

1.2方法

1.2.1主要試劑 兔抗人HGF多克隆抗體(工作濃度1∶200)、兔抗人C-Met多克隆抗體(工作濃度1 ∶ 300)、兔抗人VEGF多克隆抗體(工作濃度1 ∶ 200)、免疫組織化學(xué)(PV-9000二步法)山羊抗兔二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2檢測方法 采用免疫組織化學(xué)PV-9000二步法。切片常規(guī)脫蠟，梯度水化，PBS(pH7.4)沖洗3 min×3次，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液微波爐加熱修復(fù)抗原，PBS沖洗3 min×3次，3%過氧化氫去離子水室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3 min×3次，分別滴加HGF、C-Met和VEGF一抗工作液，放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜，次日取出室溫放置30 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB染色，蘇木素復(fù)染，返藍，中性樹膠封片。所有染色均在相同條件下進行，各組均留取一張切片作HE染色。用已知陽性的甲狀腺癌組織切片作為陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照，重復(fù)以上步驟。

1.3結(jié)果判定 結(jié)合陽性對照片中典型陽性細胞的著色特征，在排除邊緣效應(yīng)、刀痕等非特異性染色干擾因素的前提下，將實驗片上胞膜出現(xiàn)棕黃色著色和(或)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞判定為陽性染色細胞。參照 Tetsuji Yamamotoa[6]等的免疫組織化學(xué)染色評分法，采用陽性細胞百分率的半定量法來判定染色結(jié)果，同時記錄陽性染色標(biāo)本的百分率。選擇具有代表性的5個典型高倍視野(×400)，每個視野內(nèi)隨機計數(shù)100個細胞，共計500個細胞。陽性細胞百分率用分值表示：0=不表達，1=<10%，2=10%～50%，3=>50%。每張片子5個視野的陽性細胞百分率平均分值為該標(biāo)本的最后染色分值。最后平均染色分值為0～1的標(biāo)本記為染色陰性標(biāo)本，平均分值>1的記為染色陽性標(biāo)本。所有結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師獨立評定，結(jié)果判讀經(jīng)兩位主任病理醫(yī)師審核確認(rèn)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，子宮癌組織組、子宮肌瘤組織組和正常組織組之間，HGF、C-MET和VEGF染色分值比較采用秩和檢驗，HGF、C-MET和VEGF染色陽性標(biāo)本百分率比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 HGF蛋白陽性染色為腫瘤組織間質(zhì)細胞及腫瘤細胞的細胞質(zhì)中有棕黃色或棕褐色顆粒沉著，無背景著色。C-Met和VEGF 蛋白陽性染色定位于腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)和(或)細胞膜上，被染成棕黃色，無背景著色。

2.2三組比較結(jié)果 HGF在子宮癌中的陽性表達為71.43%(20/35)，顯著高于子宮肌瘤組8.57%(3/35)和正常子宮組2.86%(1/35)，P<0.01；C-Met在子宮癌中的陽性表達為51.43%(18/35)，顯著高于子宮肌瘤組織8.57%(3/35)和正常組織5.71%(2/35)，P<0.01；VEGF在35例正常組織中呈微弱表達或不表達，僅有1例有陽性表達，占百分比為2.86%，而在35例子宮癌組織中有29例為蛋白陽性表達(82.86%，P<0.01)，子宮肌瘤組織中VEGF蛋白的陽性表達率與正常組織無顯著性差異，P>0.05。HGF陽性標(biāo)本百分率結(jié)果見表1，三組平均表達率比較見圖1。

表1 對照組與腫瘤組HGF陽性標(biāo)本百分率和染色分值比較

圖1組間表達水平變化趨勢圖

3 討論

肝細胞生長因子(hepatocyte gowth factor,HGF)是Nakamura[7]從部分肝切除的大鼠血漿中分離出的一種能強烈刺激肝細胞生長的細胞因子，又被稱為擴散因子或分散因子(scatter factor,SF)。它由間質(zhì)細胞產(chǎn)生，可通過旁分泌或自分泌方式作用于鄰近細胞，與細胞表面受體C-Met結(jié)合并激活該受體的酪氨酸激酶活性，從而促進肝細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、黑色素細胞、造血細胞及多種腫瘤細胞的有絲分裂、遷移以及形態(tài)發(fā)生，并參與組織再生、傷口愈合、胚胎發(fā)育及血管形成等多種生理過程。HGF和(或) C-Met在許多惡性腫瘤如肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用已得到證實[8]。

C-Met蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是由原癌基因C-Met編碼表達的一種膜受體，被認(rèn)為是HGF的唯一受體。C-Met與HGF結(jié)合后組成信號通路而發(fā)揮作用，如促進細胞增殖、遷移、形態(tài)改變以及促進腫瘤血管增生等[9]。過度表達HGF可誘導(dǎo)C-Met受體酪氨酸激酶自體磷酸化、經(jīng)細胞內(nèi)蛋白級聯(lián)反應(yīng)，激活Met-Ras-MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、破壞細胞黏附分子和細胞骨架的連接作用，促進細胞增殖、分化、移動和侵襲以及促進新生毛細血管形成，這些均利于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

血管內(nèi)皮生長因子(vascul endothelial growth factor,VEGF)是血管內(nèi)皮細胞特異性的多肽因子，有刺激血管內(nèi)皮細胞增生、增加血管通透性、誘導(dǎo)新生血管生成的作用。是目前發(fā)現(xiàn)的最強刺激血管生成因子之一，也是作用最強的血管通透性因子，其作用是組胺的50000倍。VEGF在炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長等多種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，特別是在腫瘤新生血管形成和和血道轉(zhuǎn)移中的作用已成為熱點并得到廣泛證實。

Enc等[10]應(yīng)用HGF與VEGF聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)毛細血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯超過單獨應(yīng)用VEGF培養(yǎng)，表明HGF與其受體C-Met結(jié)合可上調(diào)VEGFmRNA的表達。Dong[11]認(rèn)為，HGF/C-Met信號途徑主要通過PI3和MEK這兩個關(guān)鍵激酶途徑各自獨立作用，上調(diào)促進轉(zhuǎn)移的細胞因子IL-8和VEGFs的表達水平，促進腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后惡化。Xin等[12]通過轉(zhuǎn)基因方法證實HGF和VEGF在促進新生血管形成方面具有協(xié)同作用。

本研究采用免疫組織化學(xué)PV法檢測了子宮癌組織中HGF、C-Met和VEGF蛋白的表達,結(jié)果表明，子宮癌組織中HGF、C-Met和VEGF蛋白的陽性表達率均顯著高于子宮良性腫瘤組織和正常對照子宮組織(P<0.01)；而且在子宮癌組織中，18例同時陽性或強陽性表達HGF與C-Met，二者表達呈平行趨勢，提示HGF/C-Met自分泌環(huán)在子宮癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定作用，HGF使其特異性受體C-Met基因活性增強，C-Met蛋白過度表達，并通過與HGF結(jié)合而發(fā)揮作用，促進腫瘤的惡性演進。

以上結(jié)果說明，HGF、C-Met蛋白的高表達與子宮癌的發(fā)生和進展、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。可能的機制為異常增加的HGF激活C-Met蛋白，導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，經(jīng)瀑布式的磷酸化反應(yīng)，通過MAPK、PI3 k等信號傳導(dǎo)通路，將信號逐級放大，轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機構(gòu)[13]，促進細胞的異常增殖，抑制細胞凋亡，導(dǎo)致子宮癌的發(fā)生。血管形成和細胞外基質(zhì)ECM的降解是腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，HGF異常高分泌可促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF的上調(diào)，促進腫瘤組織血管的生成；通過誘導(dǎo)細胞骨架結(jié)構(gòu)重排、黏附分子激活、細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤組織的浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，HGF、C-MET和VEGF在子宮癌組織中均有陽性表達，可能與子宮癌的生物學(xué)行為相關(guān)，它們相互作用，共同影響子宮癌的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤早期起重要作用。HGF、C-MET和VEGF表達反應(yīng)了子宮癌的潛在惡性程度和分化程度，可作為子宮癌早期診斷、預(yù)測轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，為臨床治療方案的選擇及評估預(yù)后提供依據(jù)，有望成為抗瘤體新靶標(biāo)，開拓腫瘤間質(zhì)治療新途徑。但是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多因子參與的過程，復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的精確的調(diào)節(jié)機制還需要進一步的研究。

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ClinicalSignificanceofHGF、C-MetandVEGFExpressioninUterineCancerTissue

YINHua-wei.

ShandongMedicalCollege，Linyi276000，China

ObjectiveTo test the HGF,C-Met and VEGF expression in the uterine cancer,analyse their effects in occurrence,development and aggressive of the womb cancer, and provide the theory to the formation mechanism of uterine cancer, prognostic, gene targeting therapy.MethodsCollected 35 cases of uterine surgery patients from 2009.12 to 2010.08, took the cancer cells as the team group,take 35 specimen of patients with uterine flesh tumour compared to the organization of the 1 group, at the same time, 35 patients were selected the normal medical organization as comparison group 2,applyed immunohistochemical P-V method to detect HGF, C-Met and VEGF protein expression.ResultsThe positive expression of HGF in the womb cancer was 71.43%(20/35), significantly higher than uterine fibroids organization 8.57%(3/35) and normal tissue 2.86%(1/35),P< 0.01,C-Met in the expression of uterine cancer was 51.43%(18/35), significantly higher than uterine fibroids organization 8.57%(3/35) and normal tissue 5.71% (2/35),P< 0.01, VEGF in 35 patients of normal tissues are faint expression, only 1 case had positive expression, accounting for percentage is 2.86%, and in 35 patients in the uterus cancer cells 29 patients (82.86%，P<0.01)for protein expression positive, the fibroid tissue has no significant differences and normal tissue,P> 0.05.ConclusionHGF, C-Met and VEGF expressed significantly raised in uterine cancer, may be one of the factors that contributed to the womb cancer.

Uterine cancer; HGF; C-Met; VEGF

276000 臨沂，山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校