乙型病毒性肝炎患者檢測HBV基因分型、耐藥變異的價(jià)值和意義

陳海雁 張桂花 魏威 羅錦彬 黃舒婷

乙型病毒性肝炎患者檢測HBV基因分型、耐藥變異的價(jià)值和意義

陳海雁 張桂花 魏威 羅錦彬 黃舒婷

目的通過一體化鑒定探討乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異的臨床價(jià)值與意義。方法選取本院收治的73例乙肝病毒肝炎患者，以拉米夫定為首選治療藥物，以阿德福韋酯和恩替卡韋為耐藥患者替代治療藥物；所有患者均取清晨空腹靜脈血，利用 MassARRAY Assay和實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)進(jìn)行基因分型和耐藥變異測定，對(duì)其用藥情況進(jìn)行為期3年的追蹤分析。結(jié)果基因分型：本組病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未見其他基因分型患者。耐藥變異：在為期3年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異33例(45.21%)，其中B型變異率27.5%(11/40)，C型變異率68.75%(22/32)，D型無變異，各基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療1、2、3年的耐藥變異率分別為3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),隨著治療時(shí)間的延長顯著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD變異為主，占81.82%(9/11),其余2例為YIDD變異(18.18%)，C型基因均為YIDD變異，其變異類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，對(duì)乙型病毒性肝炎的抗病毒治療效果有一定影響，利用MassARRAY Assay高通量技術(shù)建立HBV基因分型、耐藥變異、前C區(qū)/BCP區(qū)突變檢測技術(shù)，可為乙型病毒性肝炎的臨床診治提供指導(dǎo)性策略。

HBV基因分型；耐藥變異；MassARRAY Assay；核苷(酸)類似物

1 資料與方法

1.1一般資料 ①研究對(duì)象:選取本院2008年1月至2009年12月收治的73例乙型病毒性肝炎患者為研究對(duì)象；其中男47例，女26例，年齡34～51歲，平均(41.7±6.4)歲。②主要儀器:基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDL-TOF-MS, Sequenom)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500FAST, ABI)； 低溫超重離心機(jī)(AllegraTM 64RCentrifuge, BECKMAN)

1.2研究方法 治療方法:所有患者入院后均給予常規(guī)營養(yǎng)支持和保肝治療；在此基礎(chǔ)上，以拉米夫定為首選抗病毒藥物，并以阿德福韋酯和恩替卡韋為耐藥患者替代治療藥物。②基因測定方法:①標(biāo)本采集:采取清晨空腹肘靜脈血3 ml，4℃冰箱過夜；并以4℃、4000r/min離心分離血清，-20℃保存。DNA提取和PCR 擴(kuò)增:常規(guī)煮沸法提取血清DNA，由Assay Designer軟件包設(shè)計(jì)PCR引物；采用 MassAR-RAY TM Analyzer 技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行 HBV-DNA P 區(qū)檢測。a.常規(guī):PCR條件：體系：滅菌雙蒸水1 μl；10×PCR buffer 0.625 μl；2.5 mmol dNTP 1 μl；引物 1 μl；HotStar Taq 酶 0.1 μl。溫度：42℃ 5 min， 95℃ 3 min；(94℃ 15 s， 55℃ 25 s， 72℃ 50 s，40個(gè)循環(huán))； 72℃ 7 min。b.測序:PCR 條件：體系：滅菌雙蒸水1 μl；iPLEX buffer 0.2 μl；終止混合物 0.2 μl； iPLEX 酶 0.041 μl；引物 0.804 μl。溫度：94℃，2 min；(94℃，5 s； 52℃，5 s； 80℃，5 s；40 個(gè)循環(huán))72℃， 3 min。③序列分析:MassARRAY Nanodispenser處理PCR終產(chǎn)物，并用MALDL-TOF-MS儀進(jìn)行基因分析；使用 MassARRAYRT 軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)讀取分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以構(gòu)成比或百分率表示，采用 SPSS 17.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)： α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基因分型 本組病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未見其他基因分型患者。

2.2耐藥變異 在為期3年的追蹤治療中，共發(fā)生耐藥變異33例(45.21%)，其中B型變異率27.5%(11/40)，C型變異率68.75%(22/32)，D型無變異，各基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療1、2、3年的耐藥變異率分別為3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),隨著治療時(shí)間的延長顯著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD變異為主，占81.82%(9/11),其余2例為YIDD變異(18.18%)，C型基因均為YIDD變異，其變異類型差異顯著(P<0.05)；見表1。

表1 乙肝病毒耐藥突變情況

3 討論

干擾素和核苷(酸)類似物為乙肝治療的兩大主體藥物，基于僅20%～30%的 HBeAg 陰性患者對(duì)干擾素有應(yīng)答，且干擾素治療有一定的肝毒性，其適用范圍較窄，效率相對(duì)較低。核苷(酸)類似物具有給藥途徑便捷，病毒抑制效應(yīng)強(qiáng)，毒副作用小等優(yōu)勢，在乙肝的治療中取得了顯著療效，尤以拉米夫定使用最為廣泛[2]。然而，基于其HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率低，存在乙肝病毒耐藥性變異現(xiàn)象，長期療效不佳，為目前限制其抗乙肝病毒治療療效的主要因素[3]。

本文應(yīng)用MassARRAY Assay技術(shù)[4]，對(duì)乙肝病毒的基因分型及患者藥物治療過程中的病毒變異耐藥位點(diǎn)做一體化鑒定研究；結(jié)果顯示，45.21%的患者可發(fā)生耐藥變異，隨著用藥時(shí)間的延長，變異率準(zhǔn)年升高，且C基因型的變異率顯著高于B基因型。部分文獻(xiàn)報(bào)道表明[5]，B基因型應(yīng)用拉米夫定的持久有效性顯著優(yōu)于C基因型，與本院研究結(jié)果有較強(qiáng)一致性。本研究結(jié)果提示，基因型對(duì)抗病毒療效的影響是與耐藥變異的發(fā)生密切相關(guān)的。提示早期HBV YMDD變異檢測對(duì)拉米夫定抗病毒長期療效有預(yù)測作用。

綜上所述，乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐藥變異具有一定的相關(guān)性，對(duì)乙型病毒性肝炎的抗病毒治療效果有一定影響，利用MassARRAY Assay高通量技術(shù)建立HBV基因分型、耐藥變異、前C區(qū)/BCP區(qū)突變檢測技術(shù)，在充分發(fā)揮高通量優(yōu)勢的同時(shí)，又可實(shí)現(xiàn)檢測自動(dòng)化和集成化。可同時(shí)檢測多個(gè)突變位點(diǎn)，針對(duì)多個(gè)耐藥位點(diǎn)同時(shí)分析，為乙型病毒性肝炎的臨床診治提供指導(dǎo)性策略。

[1] 李華建,丁伯敬,王嶸嶸.乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變檢測研究.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(19):5066-5067，5070.

[2] 覃霞,杭曉峰,徐文勝,等.急性乙型肝炎患者血清HBV基因耐藥變異及相關(guān)因素分析.肝臟,2012,17(12):843-845，886.

[3] 譚朝霞,湯影子,況雪梅,等.核苷類似物干預(yù)下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶區(qū)基因突變檢測分析.重慶醫(yī)學(xué),2011,40(13):1254-1256.

[4] 王春霞,甄宏斌,朱文鵬,等. MassARRAY技術(shù)高通量檢測乙肝病毒C區(qū)/C啟動(dòng)子區(qū)基因變異.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(22):5920-5923.

[5] 劉映霞,位興輝,羅志雄,等.乙型肝炎患者HBV基因型與核苷(酸)類似物耐藥變異的關(guān)系.中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版),2007,1(2):86-91.

516211 惠州市惠陽區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(陳海雁 張桂花 羅錦彬 黃舒婷)；南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(魏威)

乙型病毒性肝炎為我國發(fā)病率較高的傳染病之一，基于乙肝病毒傳播途徑廣泛，其傳染率居于各類傳染病前列。研究結(jié)果顯示[1]，乙型病毒性肝炎病情遷延，無有效根治手段，隨著發(fā)病程度的加深，可發(fā)展為肝硬化、肝癌等嚴(yán)重器質(zhì)性病變，給家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，抗病毒治療是控制其病情進(jìn)行性擴(kuò)展的主要手段，以干擾素類和核苷(酸)類似物為其兩大主治藥物。基于干擾素的適用面窄，治療效率相對(duì)偏低，臨床多以核苷(酸)類似物為主。研究表明，病毒耐藥性變異為制約核苷(酸)類似物臨床療效的主要障礙，惠州市惠陽區(qū)人民醫(yī)院以MassARRAY Assay技術(shù)為依托，對(duì)本地區(qū)常見乙肝病毒的基因分型和耐藥位點(diǎn)做鑒定分析，以期為抗病毒療效評(píng)價(jià)和用藥方案的調(diào)整提供依據(jù)。