宮頸癌Ku80和ATM的表達與放射敏感性的關(guān)系

北京市順義區(qū)醫(yī)院（101300）陳小燕

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院（430030）熊華 許三鵬 于世英Δ

DNA是輻射致死效應中細胞內(nèi)最重要的生物靶，DSB（double strand break，雙鏈斷裂）可引起DNA片斷丟失造成基因缺失，故DSB與放射敏感性密切相關(guān)[1]。近年來國外研究報道，Ku80和ATM在DSB中起重要作用[2]。筆者采用免疫組化方法檢測47例宮頸癌患者放療前癌組織中Ku80和ATM蛋白的表達，結(jié)合患者對放療的近期療效，探討其與放射敏感性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 單純放療結(jié)束時宮頸局部病變未消失，或病變消失但于6個月內(nèi)再次出現(xiàn)同樣病理類型的腫瘤稱為局部未控，若于6個月以上宮頸或?qū)m旁出現(xiàn)同樣病理類型的腫瘤稱為復發(fā)[3]。選擇我院2009年10月～2011年6月收治的部分宮頸癌病例47例，均經(jīng)病理學證實，有完整隨訪資料。其中完全緩解（CR）34例，定為放射敏感組；局部未控9例和復發(fā)4例共13例，定為放射耐受組。患者年齡22～68歲，平均年齡45.9歲，活檢前均未接受過放射治療和/或化療（見附表1）。患者均實施根治性放射治療。放射治療外照射采用直線加速器15MvX射線，盆腔前后野照射，每次2Gy，每天1次，每周5次，盆腔中心總劑量46Gy/23次/4.5周；外照射2周后開始行腔內(nèi)放療，每周1次，A點劑量18～24Gy每3～4次（后裝當日不行外照射）。

附表1 放射敏感組和耐受組臨床資料比較

1.2 方法 放療前取宮頸腫瘤組織，石蠟包埋組織，4μm連續(xù)切片兩張，分別行Ku80和ATM免疫組化染色。操作步驟按試劑盒說明書進行：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，50mmol/L TrisEDTA緩沖液中（pH9.0）微波修復抗原15min，3%BSA封閉非特異性背景，滴加Ku80（1∶200）、ATM（1∶200）單克隆抗體（Santa Cruz），室溫作用60min，按SP試劑盒說明書進行生物素標記二抗和鏈霉素卵白素標記辣根過氧化物酶作用，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。同時以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知乳腺癌陽性片作為陽性對照。

附表2 放射敏感組與耐受組放射治療前癌組織Ku80表達

附表3 放射敏感組與耐受組放射治療前癌組織ATM表達

附表4 宮頸癌組織Ku80和ATM表達

1.3 組織形態(tài)學觀察和結(jié)果判斷 免疫組化染色結(jié)果以Ku80或ATM蛋白在癌細胞胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性，觀察陽性反應采用雙盲法。結(jié)果判定綜合染色強度和陽性細胞百分數(shù)。SP法染色不著色為陰性（-）記為0分；淡棕黃色為弱陽性（+）記為1分；深棕黃色為強陽性（+++）記為3分；陽性著色介于弱陽性和強陽性之間為（++）記為2分。陽性細胞＜6%記為0分；6%～25%記為1分；25%～50%記為2分；51%～75%記為3分；76%～100%記為4分。綜合判定取二者分值之積：0分為（-）；1～4分為（+）；5～8分為（++）；9～12分為（+++）。

1.4 放射治療前記錄患者的血紅蛋白濃度（Hb）和紅細胞數(shù)（RBC） 分為正常組（Hb≥120g/L）、輕度貧血組（Hb＝90～119g/L）、中度貧血組（Hb＝60～89g/L）和重度貧血組（Hb＜60g/L）。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗、t檢驗及Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Ku80蛋白的表達 Ku80陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細胞的胞核（見附圖 1）。51.1%（24/47）的患者Ku80陰性，48.9%（23/47）Ku80陽性。在Ku80陰性患者中，21例CR，3例未控或復發(fā)；Ku80陽性患者中，13例CR，10例未控或復發(fā)。比較CR和未控/復發(fā)，Ku80陰性腫瘤對放療的反應較Ku80陽性者明顯要好。放射敏感組及耐受組宮頸癌放射治療前其活檢組織Ku80表達情況見附表2，χ2檢驗結(jié)果顯示放療前此兩組活檢癌組織Ku80表達有顯著差異（P＝0.024），耐受組Ku80表達率高于敏感組。

2.2 ATM蛋白的表達 ATM陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細胞的胞核（見附圖2）。40.4%（19/47）的患者ATM陰性，59.6%（28/47）ATM陽性。在ATM陰性患者中，17例CR，2例未控或復發(fā)；ATM陽性患者中，17例CR，11例未控或復發(fā)。比較CR和未控/復發(fā)反應，ATM陰性腫瘤對放療的反應較ATM陽性者明顯要好。放射敏感組及耐受組ATM表達情況見附表3，χ2檢驗結(jié)果顯示放療前此兩組ATM表達有顯著差異（P＝0.046），耐受組ATM表達率高于敏感組。

2.3 Ku80表達與ATM表達的關(guān)系 Ku80（-）/ATM（-）患者占25.5%（12/47）；Ku80（+）/ATM（+）患者占34.0%（16/47）；Ku80（-）/ATM（+）患者占25.5%（12/47）；Ku80（+）/ATM（-）患者占14.9%（7/47）。Ku80與ATM蛋白表達之間無顯著相關(guān)（r＝0.199），見附表4。

2.4 Ku80、ATM、放射敏感性與血紅蛋白濃度、紅細胞數(shù)的關(guān)系 Ku80、ATM、放射敏感性與血紅蛋白濃度、貧血程度及紅細胞數(shù)均無相關(guān)性（r＞0.05）。放射敏感組與放射耐受組的血紅蛋白濃度、貧血程度及紅細胞數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；不同貧血程度其Ku80、ATM表達無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

細胞的DNA損傷修復是決定細胞輻射敏感性的主要因素之一，腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂修復率與細胞對輻射的敏感性呈負相關(guān)。多數(shù)輻射敏感細胞具有DSB修復缺陷。在生物的進化過程中，為了對抗DSB損傷，細胞形成了兩條獨立而又互補的DSB重組修復途徑即同源重組（homologyrecombination，HR）和非同源末端連接（non-homologyendjoining，NHEJ）[4]。

Ku蛋白是Ku70和Ku80的雜二聚體，是從輻射敏感的哺乳動物細胞中分離得到的、與DNA損傷修復相關(guān)的基因（XRCC-7和XRCC-5）產(chǎn)物。Ku蛋白首先識別DSB，激活DNA-PKcs，然后啟動DNA修復的NHEJ信號轉(zhuǎn)導通路級聯(lián)反應[2]。已有實驗證明，缺乏Ku80的細胞或動物對放射線敏感[5]，用Ku80的cDNA轉(zhuǎn)染DNA雙鏈斷裂修復缺陷細胞后，能夠恢復其DNA雙鏈斷裂的重接能力，從而增加細胞的輻射抗性[6]。分級分期高的移行上皮癌中Ku70、Ku80 mRNA表達比低分級分期的癌低，提示Ku下調(diào)與膀胱腫瘤的惡性進展有關(guān)[7]。

蛋白激酶ATM是哺乳動物中與HR有關(guān)的蛋白質(zhì)。ATM蛋白是毛細血管擴張性共濟失調(diào)綜合征的致病基因編碼的一個分子量約350kd的蛋白，它廣泛表達于人體各種組織細胞中。ATM調(diào)整由于DNA損傷引發(fā)的DNA修復和凋亡通路。該通路主要表現(xiàn)為DNA損傷激活ATM激酶，ATM激酶磷酸化其下游的相應蛋白，使細胞在細胞周期關(guān)卡處停滯分裂，主要是G1-S期和G2-M期的阻滯，使損傷的DNA得以修復，當修復失敗時，細胞進入凋亡進程[2]。已有研究表明ATM蛋白表達水平差異與細胞放射敏感性程度之間密切相關(guān)[8]。

目前，雖然對于DSB的兩條重組修復途徑有了一定的了解，但還有許多問題尚未完全清楚。Wang報道，經(jīng)過電離輻射后，Ku80（-/-）細胞比Ku80（+/+）細胞顯示更強的G（2）期集聚。Ku80（-/-）細胞的G（2）檢測點反應不依賴于ATM，而伴隨有CHK1激酶活性增高[9]。Zhou報道[10]，與其野生型相比，Ku80（-/-）細胞經(jīng)照射后有更強的S期檢測點反應，該反應與DNA-PK無關(guān)，而與高ATM活性和更多ATM結(jié)合于DNA有關(guān)。本實驗采用免疫組化的方法檢測宮頸癌Ku80和ATM蛋白的表達，結(jié)果顯示：Ku80在放射敏感組和耐受組的陽性率分別為38.2%（13/34）和76.9%（10/13），兩組間有顯著差異（P＝0.024）；ATM在放射敏感組和耐受組的陽性率分別為50.0%（17/34）和84.6%（11/13），兩組間亦有顯著差異（P＝0.046）；但Ku80和ATM之間無明顯相關(guān)（r＝0.199）。說明Ku80和ATM作為DSB識別和修復的哨兵，分別在宮頸癌的放射敏感性方面起重要作用，Ku80或ATM高表達導致放射耐受，患者對放療的反應差，Ku80或ATM均可單獨作為宮頸癌放療敏感性的預后指標，二者通過各自獨立的不同途徑修復DSB，并對放射敏感性產(chǎn)生影響。

附圖1 宮頸癌組織Ku80表達

附圖2 宮頸癌組織ATM表達

乏氧是實體腫瘤的共同特征。在腫瘤放療中，射線對腫瘤細胞的殺傷作用在很大程度上取決于乏氧細胞的數(shù)量和細胞的氧含量，氧是最強的放射增敏劑。關(guān)于ATM與乏氧之間的關(guān)系的研究認為，乏氧本身并不引起ATM反應，而是腫瘤在乏氧時緊隨著的再氧合階段能誘發(fā)顯著的DNA損傷和ATM反應[11]。尚未見Ku80與乏氧關(guān)系的研究報道。有研究者認為，血紅蛋白是體內(nèi)主要的攜氧成份，血紅蛋白濃度的改變可影響組織的含氧量，影響腫瘤組織乏氧細胞的百分比，使腫瘤放射敏感性發(fā)生變化，并報道放療前血紅蛋白濃度越接近正常，放療后腫瘤局部控制越好[12]。本研究未發(fā)現(xiàn)血紅蛋白水平、紅細胞數(shù)與Ku80、ATM、放射敏感性之間有相關(guān)性。Sasai K[13]報道在判斷腫瘤對放射治療的反應時動脈血氧含量比血紅蛋白水平更重要，結(jié)合本研究結(jié)果，認為不能單純以血紅蛋白水平來表示腫瘤的乏氧狀態(tài)。

由此推論，檢測宮頸癌Ku80和ATM蛋白可在一定程度上提高對放射敏感性的預測，指導患者制定個體化的治療方案，提高療效，并為宮頸癌的基因治療提供理論依據(jù)。