標準化臨床樣本庫的創建與管理

楊靜芳， 陳 凌， 張新勝， 卞琳琳， 吉訓明

(首都醫科大學宣武醫院，北京市老年病醫療研究中心科研處，北京 100053)

0 引言

標準化、高質量的樣本庫是重大疾病基礎與臨床研究、臨床診治技術研發、藥物研發、健康研究與產業化，即實現轉化醫學的最寶貴資源。隨著生物醫藥研究的飛速發展，臨床樣本資源的重要性已經得到廣泛的重視和充分的認識。臨床樣本是不可再生的寶貴資源，高質量的臨床研究樣本對探索新的治療方法、發現新的診斷工具、制定新的診斷指標以及新藥的研發都凸顯出極其重要的意義。醫學臨床樣本的收集管理和利用日益引起發達國家醫學研究工作者的重視，國外早已建立了標準化的樣本庫且信息化管理機制不斷完善。目前，國際知名的樣本庫有聯合了幾大歐洲重點生物庫的泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRIhttp://www.bbmri.eu)，英國生物樣本庫(UK Biobank，http://www.ukbiobank.ac.uk)及法國國家健康與醫學研究院 (INSERM，http://www.english.inserm.fr)等。

中國有龐大的臨床樣本資源，且有能力將其妥善處理并加以保存。建設高質量、高標準的樣本庫將給我國的生物醫藥產業、生命科學的基礎研究和臨床研究提供強有力的支撐[1]。然而，目前我國綜合醫院臨床樣本庫建設尚處于初創階段，由于缺乏足夠的交流與溝通，不同的樣本庫在建設過程中沒有統一的標準，在管理和質量水平上存在角度的差別，同國外的樣本庫也存在著一定的差距[2]。近期，通過實地調研及國際交流等方式，就綜合醫院臨床樣本庫的建立與管理做了一些相應的考察、研究和分析。

1 資料與方法

(1)文獻復習。通過清華同方中國期刊全文數據庫(CNKI)、中國科技論文統計數據庫(CSTP)及萬方數據庫，以“樣本庫”為關鍵詞，檢索2006～2011年相關中文文獻。共獲得文獻81篇，選取其中與醫學衛生或生物科學相關且有代表性的22篇文獻進行學習，對樣本庫的建設和管理有了理論認識。

(2)實地調研。2011年6月赴上海對第二軍醫大學東方肝膽外科醫院國家肝癌樣本庫[3-4]進行實地調研，并與樣本庫管理人員、工作人員及樣本管理系統的軟件開發人員(上海生物信息技術研究中心)進行面對面交流，學習建庫的成功經驗。該樣本庫啟動于2008年，依托于國家科技重大專項課題建立了專業性的肝癌樣本庫，利用雙重條形碼技術結合樣本信息化管理系統實現了臨床組織樣本庫的標準化管理[5-7]，是臨床組織樣本庫標準化建設試點單位之一。

(3)國際交流。2010年10月參加2010第二屆中國組織生物樣本庫的標準化建設與應用研討會，于2011年7月參加國際標準化生物樣本庫的管理與質控會議暨2011年上海生物樣本庫建設研討會，于2012年6月參加第四屆中國生物樣本庫標準化建立與應用研討會，于2013年3月參加《ISBER最佳實踐2012》培訓，于2013年4月參加《生物樣本庫質量管理實戰培訓》[8-11]。目前，有關生物樣本庫的國際交流平臺主要集中在上海，歷次會議匯集了泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRI)、英國生物樣本庫(UK Biobank)、法國國家健康與醫學研究院(INSERM)等國際著名的生物樣本庫建設主體單位負責人及國內知名樣本庫的負責人。會議期間，通過與國內外專家學者進行面對面的交流討論，深刻領悟了樣本庫建設的重大意義及標準化管理的迫切性。

(4)政策法規及行業標準學習。通過互聯網檢索國際及國內有關遺傳資源及樣本庫建設方面的政策法規、行業標準、技術規范、標準操作規程(SOP)等文件。學習并了解了國際上的行業標準一般遵循ISO 9001認證或OECD(Organization for Economic Co-operation and Development)指南。而我國目前沒有統一的行業標準，對樣本庫的資質也沒有統一的國家認證。我國臨床樣本庫的現狀是，依托于研究項目或課題的資金資助，建立適用于各自項目的技術規范和標準體系。所謂“標準化”實際上很難統一，短時間內很難建立國家的行業標準。由于人類遺傳資源的特殊性質，涉及倫理學問題，因此，國際上遵循HUGO倫理委員會章程，而我國于1998年出臺的《人類遺傳資源管理暫行辦法》(國辦發[1998]36號)則為遺傳資源的保護、開發利用及倫理學方面提供了法律依據。

2 結果

2.1 臨床樣本庫的建立

(1)基礎設施與儀器設備。要求具有獨立空間，設置專門的庫房，面積根據樣本庫庫存量而定，但基本的區域應該具備:標本出入庫登記區、標本處理區、臨床資源數據庫區、冷凍區(劃分－80℃超低溫冰箱、－150℃液氮罐兩個溫度冷凍區)、標本分析區等(見圖1)。另外，樣本庫必須具備專用電源及備用電源、空調及實時監控設施。

圖1 樣本庫架構

(2)實施方案與技術路線。臨床樣本庫建立的基本路線是收集、保存、利用，其基本原則是臨床醫生提出需求，針對某種疾病的樣本進行有目的收集，而不是任何臨床樣本都要收集。① 臨床醫生一定要參與樣本收集，與患者或家屬簽署知情同意書，并對臨床信息進行采集，以保證標本的相關資料收集保存完整。②樣本庫的工作人員需具有責任心及相應的專業技術知識，樣本收集的關鍵在于樣本的質量，操作過程應避免外界污染以及標本之間的交叉污染，嚴格控制標本離體時間，從而確保標本的質量，樣本的收集一定按照嚴格的標準操作規程(SOP，見圖2)，每個崗位由專人負責，并進行崗前培訓。③樣本庫建立目的是為了利用，只有充分利用樣本庫的資源達到物盡其用，才能避免“垃圾進，垃圾出”的后果。最后，樣本庫的成敗在于規范化管理，只有按照一定標準進行收集、保存及利用，才能真正發揮樣本庫的作用，為臨床研究服務。總之，臨床樣本庫的建立和正常運行需要醫院各部門(臨床科室、手術室、病理科、設備科)協調配合，尤其需要醫院領導的大力支持，并得到本單位倫理委員會的批準。

圖2 樣本采集標準操作規程

2.2 標本的質量控制

(1)組織標本的收集、處理及保存。取材部位必須準確，一定要由病理科醫生進行取材，在腫瘤組織離體30 min內，在保證醫院病理科留取足夠用于診斷的組織標本后，按癌、癌旁(距離腫瘤組織2 cm的組織)和切緣遠端非癌組織(正常組織)，分別切成數小塊，根據應用范圍做下述3種處理:①用于RNA提取的組織:將組織標本切成厚度小于0.5 cm的小塊，投入到5倍體積的RNAlater試劑中，4℃浸泡過夜，第2 d從RNAlater中取出標本，放于凍存管中，－80℃保存。②用于DNA及蛋白提取的組織:切取小塊標本不經處理，直接放入凍存管中，置于液氮處理30 min，再轉入－80℃超低溫冰箱保存。③用于石蠟包埋的組織:標本取材后立即置10%中性甲醛水溶液固定過夜，流水沖洗約3 h，然后放入自動脫水機脫水、透明、浸蠟，再用石蠟包埋，制成蠟塊。所有的石蠟包埋組織均進一步切片，HE染色，鑒定組織形態。蠟塊和切片分別歸檔保存，HE染色切片在顯微鏡下照相存于電腦數據庫中。

(2)血液標本的收集、處理及保存。采集患者血液標本10 mL，抗凝血和非抗凝血各5 mL，做如下處理:①非抗凝血采集后室溫靜置2～3 h，以3 000 rpm離心5 min，吸出上層血清，分裝到10支凍存管內，每管約200 μL，凍存于－80℃超低溫冰箱。②抗凝血以3 000 r/min離心5 min，吸出上層血漿，分裝到凍存管中，凍存于－80℃保存。③分離血漿后的下層血液，用生理鹽水反復洗滌并離心分離白細胞后，用鹽析法提取基因組DNA，分裝凍存管中，－80℃保存。

(3)標本信息資料的記錄。主要包括以下內容:病人的一般資料(姓名、性別、年齡、民族、職業、聯系方式、住院號、病例摘要、臨床診斷、病理診斷、實驗室檢查、其他檢查等);標本資料(入庫編號、入庫時間、病變部位、標本描述、標本類型、標本數量、庫存位置等);標本使用資料(出庫編號、出庫時間、出庫數量、標本類型、實驗內容、實驗結果、使用人、使用日期、審批人等);標本廢除資料(廢除序號、廢除原因、入庫編號、標本原庫存位置、廢除日期、經手人等)。

(4)標本的定期隨機抽樣質控。對庫存標本定期隨機抽樣進行總RNA提取鑒定，對RNA樣品經紫外分光光度計分析，若得出A260/A280﹥1.6，1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見明顯的28 s和18 s條帶，而且28 s的亮度大約是18 s的1～2倍，表明RNA保存比較完整。

2.3 標本庫的規范化管理

(1)數據庫管理。在臨床樣本庫中，有大量資料需要記錄，包括患者信息、臨床資料、病理資料、標本信息和隨訪信息等。建立一套組織科學合理、信息全面而專業化的標本庫管理系統，對各類標本信息進行完善的組織和管理，是創建標本庫的前提條件[12]。標本管理系統可以根據本單位情況自行開發設計，也可以請專業的軟件開發公司個性化定制。目前，很多公司開發了針對大型臨床樣本庫而設計的標本管理軟件系統，系統運行平臺一般基于Windows XP操作系統。考慮到數據庫的安全及運行速度，最好配有獨立的服務器，以保證數據庫的高安全性和高容量。隨著醫學信息系統的日益普及和完善，作為物流跟蹤過程中的關鍵技術“條形碼技術”已在臨床醫學中得到應用。第二軍醫大學東方肝膽外科醫院建立的國家肝癌樣本庫采用雙重條形碼定位技術，同一個樣本具有兩個條形碼標簽，一個是樣本編碼，另一個是定位編碼，其編碼規則一目了然，即使由于疏忽導致樣本放錯位置，也可以根據定位編碼很容易找到其相應位置。目前，最新出現的二維碼技術[13]解決了樣本信息容量的問題，但是編碼不直觀，只能通過計算機掃描識別。另外，樣本庫信息管理系統需具備與醫院HIS系統接口，以便提取患者的基本信息和檢驗、治療、病理及隨訪等信息。

(2)標本庫管理。建立統一的管理規范，明確工作環節中的規章制度，從入庫到出庫都必須有章可循。標本庫的工作人員編制相對固定，需具備一定的技術水平和實驗室管理能力，明確標本庫工作人員職責，實現專人負責，加強對各崗位工作人員專業知識培訓，并增強對標本庫維護的責任感，保證標本從收集、保存到利用整個過程有條不紊進行。目前，中國醫藥生物技術協會組織生物樣本庫分會頒布了生物樣本庫標準[14]，規范了我國生物樣本庫的管理。

3 討論

隨著人類基因組計劃的完成，為重大疾病諸如腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病、老年病、精神疾病及遺傳病等相關基因的功能研究提供了基本藍圖。利用人類基因組工作所取得的成果，研究和了解與生理和疾病相關的基因或遺傳因素的前提就是要有疾病相關的遺傳資源，包括遺傳物質如DNA、病變組織及臨床流行病學資料等。因此，遺傳資源已成為21世紀重大疾病研究中最具有依賴性的因素。

目前，生命科學界清楚地認識到，世界范圍內的遺傳資源(生物樣本庫)網絡的創立和協作將成為重建現代生物基因組和后基因組至關重要的一步。我國也將重大疾病遺傳資源收集和保存、利用列入“十五”重大科技專項“人類重大疾病相關基因的研究”項目的子課題[15]。但是目前，這些重大疾病遺傳資源的收集、保存和利用工作還存在許多問題:① 樣本收集隨機性且無代表性;②缺乏多學科研究人員的協作;③缺乏嚴格的程序規范及行業標準;④遺傳資源的利用率低下;⑤倫理學立法有待完善。

4 結語

生物樣本庫已經成為生物醫學研究和藥品研發領域新的必備基礎和來源，它所承載的歷史使命極具挑戰性。①建立和維護一個大型的生物樣本庫，不僅僅是一項簡單的收集工作，而是要通過樣本庫將現有的寶貴的遺傳資源轉化成基因學研究的新工具，從而賦予其特定的知識價值，促進醫學科學發展。②樣本庫既不可能快速建立，也不容易維護，更是難以在短時間內成為現代生物醫藥研發中的一個完整有效的組成部分。樣本庫涉及各種復雜和交叉的知識體系網絡，其發展取決于眾多因素。最后，樣本庫創造價值的能力，取決于管理體系的建立和有序模式的建立。為了是一個樣本庫能夠正常運轉，必須要建立一系列樣本研究的科學有效性的質量管理機制。

[1] 王慶寶.生物樣本庫-轉化醫學與第六次科技革命[J].泰山醫學院學報，2012，33(1):1-3.

[2] 董哲君，肖 飛，郭 健.生物樣本庫建立現況與進展[J].中華檢驗醫學雜志，2013，36(2):130-134.

[3] 國家肝癌樣本庫數據平臺[EB/OL].http://nltb.org/.

[4] 我校東方肝膽外科醫院國家肝癌樣本庫及共享數據庫取得階段性成果[J].第二軍醫大學學報，2010，31:6.

[5] 楊 遠，劉逸敏，吳益飛，等.雙重條形碼結合信息管理平臺在臨床組織樣本庫的應用[J].中國數字醫學，2010，5(7):29-31.

[6] 張俊星，楊 遠，吳益飛，等.雙重條形碼技術在臨床組織樣本庫標準化管理中的應用[J].中國醫院管理，2011，31(3):64-65.

[7] 陸曉芳，馬 欣，周俊群，等.肝臟組織樣本庫的建立與管理[J].世界華人消化雜志，2011，19(11):1187-1190.

[8] 2010第二屆中國組織生物樣本庫的標準化建設與應用研討會紀要[J].中國醫藥生物技術，2010，5(6):472.

[9] 國際標準化生物樣本庫的管理與質控會議暨2011年上海生物樣 本 庫 建 設 研 討 會 [EB/OL].http://www.scrcnet.org/biobank2011/.

[10] 《ISBER 最佳實踐2012》[EB/OL].http://www.biobank.org.cn/inf_InfoDtlByPicLst.aspx?InfoID=384

[11] 張 俊，范錦立，張 揚，等.首屆國際標準化生物樣本庫的管理與質控會議紀要[J].中華醫學雜志，2011(36):2592.

[12] 鄧軍衛，施小六，許 毅，等.綜合醫院組織細胞庫信息系統的建立及意義[J].中國現代醫學雜志，2010，20(22):3512-3515.

[13] 郭愛華，張 翠，余永國，等.二維碼技術在生物樣本庫編碼中的應用與評價[J].中國醫藥生物技術，2012，7(4):306-307.

[14] 中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準(試行)[J].中國醫藥生物技術，2011，6(1):71-79.

[15] 劉 斌.衛生部科教司關于發布重大疾病遺傳資源的收集、保存與利用課題申報指南的通知[EB/OL].http://www.biotech.org.cn/swj/new.