Pb、Cd 單一及復合脅迫對桂花幼苗生理生化特性的影響

王 飛，胥 燾，張 晟，郭 強，聶小倩，黃應平

（1.三峽庫區生態環境教育部工程研究中心（三峽大學），湖北 宜昌 443002；2.重慶市環境科學研究院，重慶 401147）

環境中以單一重金屬元素造成污染的情況很少，常是多種重金屬元素構成復合污染，因此研究復合污染的治理更為實用。在治理重金屬污染的眾多方法中，植物修復技術受到人們的普遍關注，該方法具有投資和維護成本低、操作簡單、不造成二次污染、保護表土、減少侵蝕和水士流失等特點［1］。植物修復的關鍵技術是選育出對污染元素有較強吸收能力的超富集植物（hyperaccumulator）。迄今為止，篩選出的重金屬超富集植物有400多種［2］，其中，80%是鎳的超富集植物［3］。而對Pb和Cd同時具有超富集作用的植物種類很少［4］。目前，有關Pb、Cd單一脅迫對植物生長影響的研究已較多，但是對于Pb、Cd復合脅迫對植物生長影響的研究相對較少。

桂花（Osmanthus fragrans（Thunb.）Lour）是長江流域廣泛栽植的城市綠化、公路行道、園林景觀樹種，不僅具有綠化環境、凈化空氣、美化景觀等環境效益，而且具有重要的藥用價值［5］。而關于桂花的研究，目前主要集中在探討水分脅迫對其生長的影響，有關重金屬污染對其生長的影響鮮有報道。因此研究重金屬脅迫對桂花生長的影響，具有重要意義。本文采用含有不同濃度重金屬的土壤種植桂花幼苗，通過分析桂花幼苗生理生化指標的變化，探討Pb、Cd單一及復合脅迫對桂花幼苗生長的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桂花幼苗于三峽植物園繁育基地內購買，選取生物量大致相同的桂花幼苗，進行盆栽實驗。

1.2 試驗方法

本實驗采用規格為280 mm×320 mm的花盆，每盆裝4 kg土壤，種植3棵植株。供試土壤取自三峽大學翠屏山，基本理化性質如下：p H值6.8，有機質0.74%，Pb質量比為85.34 mg／kg，Cd質量比為0.39 mg／kg，TP質量比為244.02 mg／kg，TN質量比為537.61 mg／kg。

重金屬Pb、Cd試驗濃度設置分單一和復合脅迫，其中單一脅迫 Pb質量比分0，50，100，500，1 000和2 000 mg／kg 6個處理組，Cd質量比分0，1，10，50，100，200 mg／kg 6個處理組，復合脅迫有100 mg／kg Pb ＋ （0，1，10，50，100，200 mg／kg）Cd及10 mg／kg Cd＋ （0，50，100，500，1 000，2 000 mg／kg）Pb共12個處理組，每處理3個重復，各濃度以純Pb、Cd計。試驗在溫室內進行，植株處理6個月后采樣分析。

1.3 生理生化指標測定

葉片色素含量的測定：取0.1 g桂花幼苗葉片加入質量分數80%丙酮溶液，浸提24 h后，于665，645 nm處測定光密度，單位為 mg／g（以鮮重計）［6］。

POD活性的測定：采用愈創木酚法，稱取0.1 g桂花幼苗葉片在液氮下研磨，加入預冷的磷酸鹽緩沖液（p H 值7.8），然后在4℃ 下離心30 min（10 000 r／min），上清液在470 nm 測定光密度，單位為ku／kg表示（以鮮重計）［7］。

丙二醛（MDA）含量測定：采用硫代巴比妥酸顯色法，丙二醛（MDA）含量單位為umol／kg表示（以鮮重計）［8］。

1.4 統計分析

所有檢測重復3次，在計算機上用 Microsoft Excel 2003進行平均值和標準差的運算，結果以Mean±SD形式表示。采用SPSS和ORIGIN軟件分析數據和作圖，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗。各表中，小寫字母表示同一生長指標不同處理之間的差異，同一列中字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Pb、Cd處理對桂花幼苗葉綠素含量的影響

桂花幼苗的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a＋b含量具有一致的變化規律，都隨著重金屬處理濃度的升高而下降，葉綠素a／b值隨著重金屬處理濃度的升高表現為先升后降趨勢（見表1～表4）。重金屬單獨脅迫下，Pb處理為1 000 mg／kg時，與對照相比，桂花幼苗葉綠素a含量下降幅度為26.7%，Cd處理為100 mg／kg時，與對照相比，桂花幼苗葉綠素a含量下降幅度為36.7%，均達到了顯著水平。Pb、Cd復合脅迫下，處理濃度為10 mg／kg Cd＋2 000 mg／kg Pb時，與單獨10 mg／kg Cd處理相比，葉綠素b含量下降幅度為36.4%，處理濃度為100 mg／kg Pb＋200 mg／kg Cd時，與單獨100 mg／kg Pb處理相比，葉綠素a含量下降幅度為35.5%，均達到了顯著水平。

表1 Pb處理對桂花葉綠素含量的影響

表2 Cd處理對桂花葉綠素含量的影響

表3 Pb和10 mg·kg－1 Cd復合脅迫對桂花葉綠素含量的影響

表4 Cd和100 mg·kg－1 Pb復合脅迫對桂花葉綠素含量的影響

2.2 不同濃度Pb、Cd處理對桂花幼苗POD活性的影響

在重金屬Pb單一及固定每組10 mg／kg Cd處理和Pb不同處理濃度復合脅迫下，桂花幼苗葉中POD活性隨Pb處理濃度的增加先升高后下降（見圖1）。在Pb單一處理濃度為500 mg／kg時，POD活性最高，較對照增加了337.4%，爾后POD活性逐漸降低。固定每組10 mg／kg Cd處理，Cd和Pb復合脅迫下，在Pb處理濃度為500 mg／kg時，POD活性最高，與單獨10 mg／kg Cd處理相比增加了136.4%，爾后POD活性逐漸降低。經單因素方差分析，Pb單一及固定每組10 mg／kg Cd處理和Pb不同處理濃度復合脅迫下，桂花幼苗葉中POD活性差異顯著。

圖1 Pb、Cd單一及復合脅迫不同Pb處理下桂花幼苗葉片中POD活性

在重金屬Cd單一及固定每組100 mg／kg Pb和不同濃度Cd處理復合脅迫下，桂花幼苗葉中POD活性隨Cd處理濃度的增加先升高后下降（圖2）。在Cd單一處理濃度為50 mg／kg時，POD活性最高，較對照增加了228.4%，爾后POD活性逐漸降低。固定每組100 mg／kg的Pb處理，Cd和Pb復合脅迫下，在Cd處理濃度為1 mg／kg時，POD活性最高，與單獨100 mg／kg Pb處理相比增加了58.27%，爾后POD活性逐漸降低。經單因素方差分析，Cd單一及固定100 mg／kg Pb處理和Cd不同處理濃度復合脅迫下，桂花幼苗葉中POD活性差異顯著。

圖2 Pb、Cd單一及復合脅迫不同Cd處理下桂花幼苗葉片中POD活性

2.3 不同濃度Pb、Cd處理對桂花幼苗MDA含量的影響

圖3表示的是鉛、鎘單一及復合脅迫不同濃度鉛處理下桂花幼苗葉片中MDA含量變化。從中可以看出，桂花幼苗在Pb單一及固定每組10 mg／kg Cd處理和Pb不同處理濃度復合脅迫下，葉中MDA含量均隨著重金屬處理濃度的增加而升高。且具有很好的線性關系，決定系數分別為0.723 2和0.748 0。在Pb單一處理濃度為2 000 mg／kg時，MDA含量最高，較對照增加了192.7%，在10 mg／kg Cd處理和Pb不同處理濃度復合脅迫下，復合處理濃度為10 mg／kg Cd＋2 000 mg／kg Pb時，MDA含量最高，較10 mg／kg Cd單獨處理增加了109.1%。經單因素方差分析，Pb單一及固定每組10 mg／kg Cd處理和Pb不同處理濃度復合脅迫下，桂花幼苗葉中MDA含量差異顯著。

圖3 Pb、Cd單一及復合脅迫不同Pb處理下桂花幼苗葉片中MDA含量變化

在重金屬Cd單一及固定每組100 mg／kg Pb和不同濃度Cd處理復合脅迫下，桂花幼苗葉中MDA含量隨Cd處理濃度的增加而升高（圖4）。且具有很好的線性關系，決定系數分別為0.935 6和0.812 7。在Cd單一處理濃度為200 mg／kg時，MDA含量最高，較對照增加了156.2%，在固定每組100 mg／kg Pb和不同濃度Cd處理復合脅迫下，復合處理濃度為100 mg／kg Pb＋200 mg／kg Cd時，MDA含量最高，較100 mg／kg Pb單獨處理增加了63.0%。經單因素方差分析，在Cd單一及固定每組100 mg／kg Pb和不同濃度Cd處理復合脅迫下，桂花幼苗葉中MDA含量差異均顯著。

圖4 Pb、Cd單一及復合脅迫不同Cd處理下桂花幼苗葉片中MDA含量變化

3 討論

葉綠素是植物光合作用的物質基礎，其含量高低決定植物光合作用水平［9］。本試驗中，Pb、Cd單一及復合脅迫下桂花幼苗葉綠素均呈下降趨勢，且差異均顯著。這與王啟明［10］、徐學華等［11］研究結果一致。逆境脅迫下葉綠素含量下降的主要原因是，當Pb、Cd等重金屬離子進入植物體內以后，會通過蛋白質上的巰基結合或者取代葉綠體中的Mg2＋和Fe2＋，從而作用于葉綠素生物合成途徑中的葉綠素酯還原酶和膽色素原脫氨酶等，改變其結構，抑制酶的活性，阻礙葉綠素的合成。另有研究證明，重金屬脅迫作用于植物細胞上的主要部位是膜系統［12－13］，因此Pb、Cd能使葉綠體被膜消失，造成葉綠體不可逆損傷，導致葉綠素含量降低。

研究表明超富集植物對重金屬具有較強的耐性機制，一方面在于液泡的區室化作用和植物體內某些有機物（如MTs、PCs和有機酸等）對重金屬的螯合作用，降低了重金屬的毒性［14－16］。另一方面可能在于某些抗氧化酶系統如過氧化物酶（POD）等的反應［17－18］。本研究結果表明，桂花幼苗受到 Pb、Cd單一及復合脅迫，葉中POD活性隨著重金屬處理濃度的增加均先升后降。且100 mg／kg Pb和不同濃度Cd處理復合脅迫較Cd單獨處理，葉中POD活性先到達最大值，這可能是因為Pb和Cd對桂花幼苗的毒性產生了疊加作用。POD是植物體內清除活性氧傷害的酶保護系統之一，在除超氧自由基、控制膜脂的過氧化作用和保護細胞膜的正常代謝方面起重要作用，將H2O2催化形成H2O，從而有效阻止和H2O2的積累，限制這些自由基對膜脂過氧化的啟動［19］。Van Assche等［20］研究還發現，許多植物對重金屬的共同響應為組織中的POD活性明顯升高，說明其抗氧化酶系統在加強植物抗性方面起到重要作用。然而，酶的保護作用是有一定限度的，即使是耐性植物，其酶活性也存在一個閾值，超過這個范圍，它們的活性則要下降［21］。

植物在逆境下，細胞膜會發生膜脂過氧化作用，而丙二醛是膜脂過氧化作用的產物，故MDA含量常用來表示植物對逆境條件反應的強弱［22］。本實驗條件下，桂花幼苗MDA含量隨重金屬處理濃度的增加而增加。且同一條件下，重金屬復合脅迫葉中MDA含量較單獨脅迫要高。桂花幼苗生長過程中，在Pb、Cd脅迫下，活性氧產生和清除的代謝系統失調，活性氧和自由基在體內過量累積，造成膜脂過氧化，從而MDA含量升高。

4 結論

（1）高濃度Pb處理（1 000～2 000 mg／kg）和Cd處理（100～200 mg／kg）對桂花幼苗的生理生化特征產生了一定的負效應。Pb、Cd復合脅迫較單一脅迫，對植物的毒害作用有所加強。

（2）桂花幼苗對重金屬Pb、Cd有較好的耐性，是修復Pb、Cd污染區的潛力物種。

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