擬南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表達及多克隆抗體的制備

張 鈺，李亞會，屠唯一，陳 晨，高菊芳

(上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234)

0 引言

ERF(ethylene responsive factor)是植物所特有的一類轉錄因子．ERF家族成員在結構上有共同的特點:每個成員都含有一個大約由60個氨基酸組成的非常保守的DNA結合域，含有ERF結合域的轉錄因子在植物中廣泛存在，并且參與植物的生長發育及生理生化反應的信號轉導［1］．植物防衛信號傳遞途徑方面的研究表明:針對不同的病原物的誘導防衛反應相應地受到不同的信號傳遞途徑的調控．水楊酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)在防衛信號傳遞途徑中起著重要的作用［2］．大量證據表明:依賴于SA、ET或JA的信號傳遞途徑之間存在著一定的交叉作用(cross—talk)．絕大部分情況下，依賴于ET的信號傳遞途徑與依賴于JA的信號傳遞途徑間存在著協同促進的作用．外源ET和JA都能夠迅速誘導AtERF1表達，兩者之間存在協同促進作用［3］．而且，AtERF1的超表達能夠恢復ein2和ein l突變體的防衛反應能力．通過AtERF1轉基因擬南芥的轉錄組分析和野生型擬南芥在ET和JA處理下的轉錄組分析，說明AtERF1在體內能夠調控那些應答ET和JA的基因的表達．總的試驗結果表明:AtERF1是ET和JA信號途徑中的下游成分，而且在2個防衛反應基因調控信號途徑交織點處起著重要的作用．AtERF1基因的超表達，增強了擬南芥對灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］．但是AtERF1蛋白究竟調控哪些目的基因行使功能，目前尚不十分清楚．

原核表達系統的優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉．在本研究中，利用密碼子優化法人工合成了滿足大腸桿菌密碼子嗜好的編碼AtERF1蛋白的DNA序列［5］，并以此為基礎構建了原核表達載體AtERF1-pET29b，將其轉入大腸桿菌BL21(DE 3)，經IPTG誘導后在原核細胞中成功表達了AtERF1蛋白，該蛋白以可溶蛋白的形式存在．利用SDS-PAGE法純化了AtERF1蛋白，并作為抗原免疫家兔，制備出了效價高，特異性強的多克隆抗體，這些工作為進一步用生化手段研究該轉錄因子的DNA結合位點和下游基因奠定了基礎．

1 材料與方法

1．1 試劑和材料

1．1．1 質粒與菌株

原核表達載體pET-29b(Novagen產品)由陶黎明教授贈送，大腸桿菌感受態菌株DH5α及BL21(DE3)由上海師范大學植物功能基因實驗室提供．

1．1．2 生物學試劑

T4 DNA連接酶、限制性內切酶Nde I、Xho I和Dream Tag DNA聚合酶購自Fermenant公司;硝酸纖維素膜、dNTPs、PCR產物回收試劑盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物學試劑購自北京鼎國生物技術有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、ECL化學發光檢測試劑盒、PVDF膜購自艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司;引物由Invitrogen公司合成．

1．2 方 法

1．2．1 原核表達載體AtERF1-pET-29b的構建

AtERF1蛋白由268個氨基酸殘基組成，根據其氨基酸序列，利用密碼子優化軟件設計出一條滿足大腸桿菌密碼子嗜好的堿基序列，并引入Nde I和Xho I兩個限制性酶切位點．經優化處理的編碼AtERF1基因序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至pMD-18T載體上，上述重組質粒AtERF1-pMD-18T用NdeI，Xho I于37℃ 消化5 h，經瓊脂糖凝膠電泳，回收的AtERF1片段與同樣用NdeI，Xho I酶切的pET-29b載體進行連接，轉化入感受態E．coli DH5α中，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養基上．挑取單菌落培養后抽提質粒，進行PCR和雙酶切鑒定．酶切正確的質粒轉化BL21表達菌感受態，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養基上．挑取單菌落培養后進行PCR鑒定，含目的基因片段的BL21表達菌-70℃保存備用．鑒定引物為:

1．2．2 目的蛋白的誘導表達及可溶性分析

將含目的基因片段的BL21表達菌復蘇培養，至OD600為0．5～1．0，取1 mL菌液放入離心管中(未經IPTG誘導)．將含剩余菌液的試管轉移至20℃ 振蕩培養，當培養液溫度降至20℃時，加入IPTG，至終濃度為0．5 mmol/L進行蛋白誘導，在1、2、3、4、5 h分別收集1 mL菌液．未誘導和誘導不同時間的菌液4℃高速離心1 min，收集細菌沉淀．每管細菌沉淀加入100μL超聲緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 8．0，0．5 mmol/L NaCl)重懸，超聲1～2 min破碎細胞．吸取50μL全細胞勻漿于新的離心管，與50μL 2×SDS上樣液混合后置于100℃煮沸5min，吸取10μL樣品用12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測目的蛋白的表達情況;剩余的勻漿15000 r/min離心10 min，上清與沉淀分別與等量SDS上樣液混合后置于100℃煮沸5 min，吸取10μL電泳檢測目的蛋白的溶解狀況．PAGE膠用考馬斯亮蘭染色液染20 min后，再用脫色液脫色干凈．

1．2．3 多克隆抗體制備及效價鑒定

抗原準備:將IPTG誘導過夜的細菌裂解液上清進行SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素(NC)膜上．每只兔約需200μg抗原，依據標準分子量參照估計AtERF1蛋白條帶的含量，轉移足夠數量的NC膜．將蛋白轉移完畢的NC膜浸在麗春紅溶液中1～2 min，顯示出AtERF1蛋白條帶，立即用雙蒸水洗去麗春紅，至清晰顯示出AtERF1蛋白條帶．小心剪下AtERF1蛋白條帶處NC膜，盡量避免非目的蛋白的污染．將剪下的NC膜放置在加有滅菌PBS的1．5 mL離心管中，用滅菌PBS洗去麗春紅，至無色．用眼科剪將NC膜剪成非常細小的碎片，加入0．5 mL滅菌PBS，用組織勻漿器研磨，-70℃凍存備用．

免疫方案:取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜對成年健康家兔進行背部多點皮下注射，10 d后用相同的碾碎的樣品注射家兔．相同的實驗再重復兩次，每次間隔10 d．最后一次注射一周后，耳緣靜脈取血測定抗體效價．效價滿意后在麻醉狀態下對被免疫的兔子進行頸動脈取血，血液放37℃ 溫育1 h，然后放4℃ 過夜，析出的血清加疊氮鈉，分裝后-20℃保存．

效價測定:用免疫雙擴散法測定抗體效價．用生理鹽水配制1%瓊脂，倒平皿凝固后打梅花型孔，在中央孔中加入100μL IPTG誘導過夜的細菌裂解液上清作為抗原，周圍5孔分別加入100μL 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀釋的兔抗血清．置濕盒37℃過夜，觀察沉淀線出現的情況．

1．2．4 Western blot檢測抗體的特異性

將表達的AtERF1蛋白進行SDS-PAGE電泳后，經電轉儀轉移到PVDF膜上．將膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1．5 h，清洗后加入按1∶200稀釋于TBST中的兔多克隆抗體，在搖床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 min換一次清洗液．再加稀釋于TBST中的HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10000)，在搖床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15min換一次清洗液．洗膜后加ECL工作液，在可見光下室溫孵育膜數分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒．然后轉入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數秒，顯影定影于X光膠片上．

2 結果與分析

2．1 AtERF1蛋白原核表達載體的構建

www．arabidopsis．org 網站上列出的AtERF1的蛋白的氨基酸序列，共含268個氨基酸殘基．根據此序列設計出滿足大腸桿菌密碼子嗜好的堿基序列，并引入Nde I和Xho I兩個限制性酶切位點，堿基序列長度共816bp(圖1)．

圖1 AtERF1蛋白編碼序列的優化

經密碼子優化的序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至 pMD-18T載體上，將AtERF1-T載體經限制性內切酶Nde I和Xho I消化后，電泳結果表明AtERF1基因序列已成功克隆入pMD18-T(圖2-A)．利用T載體上的M13通用引物進行測序分析，結果表明該816bp的片段序列與優化的序列吻合．為了獲得大量的AtERF1蛋白，采用了原核表達的載體pET-29 b進行蛋白表達實驗．用限制性內切酶Nde I和Xho I將AtERF1-T載體中的 AtERF1片段切下后，將其克隆入pET-29 b，轉化E．coli DH 5α感受態后的重組質粒，用限制性酶切鑒定可以看到一條大約816 bp的條帶(圖2-B)，測序結果表明目的基因AtERF1位于正確的讀碼框中，獲得了原核表達質粒 AtERF1-pET29 b．將構建好的AtERF1-pET29 b質粒和空載體pET29 b質粒轉化入表達菌株E．coli BL21(DE3)感受態中，PCR鑒定顯示AtERF1-pET29 b含有目的基因片段(圖2-C1)，而含空載體的菌落中不含目的基因片段(圖2-C2)．

圖2 AtERF1蛋白表達載體的構建

2．2 AtERF1蛋白的原核表達

AtERF1蛋白的分子量約30 kD，按照材料與方法中所述步驟進行蛋白誘導表達實驗，SDS-PAGE電泳結果顯示，誘導4 h及5 h后，其全細胞裂解液中在35 kD～25 kD處可見清晰的AtERF1蛋白的條帶(圖3，箭頭所指 )．

圖3 AtERF1蛋白的誘導表達

2．3 AtERF1蛋白的可溶性分析

將誘導過夜的全細胞裂解液離心后的上清液進行SDS-PAGE電泳，發現在35 kD～25 kD處可見清晰的AtERF1蛋白的條帶(圖4條帶1)，說明表達的AtERF1蛋白以可溶的形式存在．

圖4 AtERF1蛋白的可溶性分析

2．4 AtERF1蛋白抗體制備和分析

將IPTG誘導過夜的細菌裂解液上清進行SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素(NC)膜上．每只兔約需200μg抗原，依據標準分子量參照估計AtERF1蛋白條帶的含量，轉移足夠數量的NC膜．用眼科剪將NC膜剪成非常細小的碎片，加入0．5 mL滅菌PBS，用組織勻漿器研磨，-70℃凍存備用．每次取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜對成年健康家兔進行背部多點皮下注射，共四次．最后一次注射一周后，耳緣靜脈取血用免疫雙擴散法測定抗體效價．抗血清經1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀釋后均能與AtERF1蛋白形成明顯的沉淀線(圖5)，表明抗體效價達到要求．對家兔在麻醉狀態下頸動脈放血，血液經37℃溫育后，4℃放置過夜析出多克隆抗血清．為了進一步分析獲得的抗體對AtERF1蛋白的識別，用Western blot技術檢測抗體，雜交后經HRP標記的羊抗兔抗體顯色試劑盒顯色，用X光膠片顯影，在膠片上可在約30 kD處看到清晰的AtERF1蛋白條帶，這表明多克隆抗體與AtERF1蛋白識別良好(圖6)．

圖5 多克隆抗體效價測定

圖6 AtERF1表達蛋白的Western blot檢測

3 討論

遺傳密碼有64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分．那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子．因此重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響，尤其是在異源表達系統［6］．

本研究利用基因全合成的方法，將擬南芥AtERF1基因序列優化為滿足大腸桿菌密碼子嗜好的序列，并逐步構建到原核表達載體pET29b．誘導表達結果顯示，構建的原核表達載體AtERF1-pET29b經IPTG誘導后，AtERF1蛋白以可溶的形式得到了高效穩定的表達．對獲得的多克隆抗血清經Western blot技術檢測，結果顯示制備的抗體與目的蛋白識別良好．

ERF轉錄因子分別與細胞發育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關［7］．AtERF1基因的超表達，增強了擬南芥對灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］，然而對于ERF轉錄因子AtERF1作用位點及下游基因的研究并不清楚．染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，Ch Ip)的方法可以用來在體內鑒定轉錄因子直接調控的下游基因，但是這些方法都需要特異性很高的蛋白抗體［8］．本研究制備的抗體與目的蛋白AtERF1特異性較強，可用于AtERF1作用位點及其直接調控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究AtERF1在花藥發育中的分子機理．

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［2］劉強，張貴友，陳受宜．植物轉錄因子的結構與調控作用［J］．科學通報，2000，45(14):1465-14741．

［3］LORENZO O，PIQUERASR，SáNCHEZ-SERRANO J J，et al．ETHYI ENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense［J］．Plant Cell，2003，15(1):165-178．

［4］BERROCAL-LOBO M，MOLINA A．Ethylene response factor 1 mediates Arabidopsis resistance to the soilborne fungus Fusarium oxysporum［J］．Mol Plant Microbe Interact，2004，17:763-770．

［5］FUGLSANG A．Codon optimizer:a freeware tool for codon optimization［J］．Protein Expr Purif，2003，31:247-249．

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