利用分子標記分析22種上海市重要水稻10個食味品質相關基因的基因型

謝米雪，郭 亮，竇蘭蘭，曹月琴，李建粵*

(1．上海師范大學生命與環境科學學院植物種質資源開發中心，上海200234;2．上海市閔行區農業科學研究所，上海201103)

稻米食味品質的評定主要包括3個理化指標，即直鏈淀粉含量(AC)、膠稠度(GC)和糊化溫度(GT)．優良食味品質稻米具有較低的AC，較高的GC及較低的GT［1-3］．Tian等［4］認為，有10個基因位點:Wx、SSII-3、SBE3、AGPiso、SSIV-2、ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2、PUL，對稻米食味品質指標影響較大．其中，決定稻米直鏈淀粉含量的主效基因是Wx;另外，SSII-3對稻米直鏈淀粉的合成影響也較大;SSIII-2、AGPlar、PUL和SSI 4個基因對稻米直鏈淀粉合成具有微效作用．影響膠稠度的主效基因也是Wx，微效基因主要有AGPiso、ISA和SBE3．而影響糊化溫度的主效基因是SSII-3，微效基因是Wx、ISA、SBE3及SSIV-2．

隨著稻米食味品質相關基因研究的深入，不少相關的分子標記已經開發出來，有的已經得到實際應用．孫華欽等［5］根據糯性水稻與非糯性水稻Wx序列位點的差異，設計了兩個可以特異識別糯性水稻的STS分子標記．Cai等［6］根據Wx第1內含子5’端剪切處的GT/TT位點的多態性與直鏈淀粉含量直接有關的特性，發展了一個CAPS(Acc I)分子標記，可區分稻米是屬于中等直鏈淀粉含量還是高直鏈淀粉含量水稻．Bao等［7］根據 SSII-3的 GC/TT多態性，開發了檢測 SSII-3的分子標記．Han等［8］根據SBE3 3’UTR的SNP差異(C/G)，開發了一個CAPS(Spe I)標記．田志喜等［9］已開發了涉及10個食味品質基因型鑒定的分子標記．

明確影響稻米食味品質功能基因，可為利用分子標記輔助選育優質食味品質水稻新品種研究奠定重要基礎．然而，在涉及利用具體水稻品種作為親本進行雜交育種前，必需先明確所使用的親本材料涉及食味品質相關基因的類型．本研究將結合利用現有報道［5-10］和本研究建立的分子標記，對22種目前在上海市主栽的常規水稻和雜交水稻親本進行10個與稻米食味品質相關基因的基因型分析．

1 材料與方法

1．1 水稻材料及基因組DNA提取

22種上海市主栽常規水稻以及雜交稻親本水稻品種或品系分別為:“秀水128”、“秀水123”、“秀水114”、“秀水134”、“光明粳一號”、“楊粳4227”、“武運粳23”、“寶農34”、“金豐”、“銀香 18”、“寒豐A”、“秋風 A”、“申9A”、“湘晴”、“R44”、“繁14”、“南粳46”、“滬嘉香軟”、“青香軟粳”、“1013”、“紫香糯861”、“滆湖香糯”．作為食味品質基因不同基因型鑒定的對照水稻品種分別有:“93-11”、“中旱3”、“蘇玉糯”、“太湖糯”、“IR36”、“IR64”．

所有水稻材料取幼嫩葉片進行基因組DNA的提取．

1．2 22種水稻基因型分析

參考前人報道，分別合成能夠擴增 Wx［5-6，10］、SSII-3［7］、SBE3［8］和 AGPiso［9］4 個基因包含 6 個檢測位點的引物序列(表1)．參照GenBank中公布的水稻Wx(GQ151055．1)基因序列，在Wx第4外顯子+693脫氧核苷酸位點兩端，利用Primer 5軟件設計一對上游和下游引物(表1);同樣參照GenBank中公布的水稻 SSIV-2(GQ151051．1)、ISA(GQ150876．1)、AGPlar(GQ150834．1)、SSI(GQ150946．1)、SSIII-2(GQ151016．1)和PUL(GQ150890．1)基因序列，在Tian等［4］報道的多態性位點兩端利用Primer 5軟件設計一對上游和下游引物(表1)．引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成．基因測序采用KOD酶，并將不同引物分別對所有水稻基因組DNA進行PCR擴增．不同基因擴增的反應程序，除了退火溫度和延伸時間有差異(表1)，其他程序均為:94℃預變性2 min、94℃變性15 s、退火30 s、68℃延伸，共32個循環，最后68℃延伸10 min．PCR產物直接電泳鑒定或酶切后鑒定采用Taq酶，不同基因擴增的反應程序，除了退火溫度和延伸時間有差異(表1)，其他程序均為:94℃預變性5 min，94℃變性45 s、退火30 s、72℃延伸，共32個循環，最后72℃延伸10 min．

表1 食味品質相關基因基因型鑒定涉及的引物序列及相關信息

續表1 食味品質相關基因基因型鑒定涉及的引物序列及相關信息

將ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2、PUL擴增產物以及針對Wx 5′UTR位點擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定與預測分子量一致后(表1)，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序分析．對于SSII-3擴增產物直接采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測．SSIV-2以及Wx第2外顯子擴增產物檢測，需采用4%瓊脂糖凝膠進行電泳分析．對于Wx第1內含子、Wx第4外顯子、SBE3以及AGPiso 4種基因擴增產物，需分別采用Acc I、Nla III、Spe I和Eco RI限制性核酸內切酶切后，再利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測．Wx 5′UTR、ISA、AGPlar、SSI、SSIII-2和 PUL擴增產物測序結果用 DNAMAN 軟件進行分析，并將后5個基因中涉及食味品質高相關性位點處的核苷酸與Tian等報道［4］進行比對．在進行基因高相關性位點核苷酸分析時，將翻譯起始密碼子ATG中第一個核苷酸A定為+1，A上游的核苷酸用“–”表示，反之用“+”表示．

2 結果與分析

2．1 22種水稻Wx基因4個位點分析

Tian等［4］根據 Wx–1160與 +111兩處的核苷酸差異，將Wx分為三種基因型．Ⅰ型在–1160處為T，在+111處有23個核苷酸插入．Ⅱ型和Ⅲ型在+111處都無核苷酸插入，但在–1160處分別為T和G．使用孫華欽等［5］設計的STS類型分子標記 We–2檢測 Wx，I型Wx的PCR產物大小為204 bp，Ⅱ或Ⅲ型PCR產物大小為181bp，所以電泳檢測能夠將Wx的Ⅰ型與Ⅱ或Ⅲ型區分開．22種水稻檢測結果顯示，只有“紫香糯861”和“滆湖香糯”為Ⅰ型 Wx(圖1)．采用 Cai等［6］設計的 CAPS(Acc I)分子標記 PCR-Acc I檢測 Wx，Ⅲ型 Wx PCR產物可被Acc I酶切，產生一條分子量為403 bp的條帶，而Ⅱ型Wx PCR產物不能被Acc I酶切，分子量仍然為460 bp．22種水稻檢測結果顯示，其余20種水稻都為Ⅱ型Wx(圖2)．

圖1 We-2對22種水稻Wx基因型檢測

圖2 PCR-Acc I分子標記對20種水稻Wx基因型檢測

22種水稻中的“南粳46”是一個含有暗胚乳特性的軟米水稻［11］．本研究根據Wang［11］等報道的軟米水稻與非軟米水稻第4外顯子+693處G/A的差異，建立了一個CAPS(Nla III)分子標記Wx-Nla III檢測方法，并對22種水稻基因組DNA進行檢測．結果發現，“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻與“南粳46”水稻一樣(圖3)，均有380和170 bp兩條帶，屬于軟米水稻，其他水稻DNA擴增產物酶切后都只有一條557 bp大小的條帶，表明它們不具有與“南粳46”水稻一樣的Wx．

圖3 Wx-Nla III對22種水稻Wx基因型檢測

另有文獻報道［12］，Wx在第1內含子上游–1216處(5′UTR)的CT重復數(CT)n與稻米直鏈淀粉含量呈反相關，即CT重復越高，稻米直鏈淀粉含量越低．因此，本研究利用郭亮等［10］設計的SSR標記分析了22種水稻Wx 5′UTR的CT重復．結果發現，“寶農34”、“金豐”、“銀香18”和“紫香糯861”都具有(CT)18，其余18種水稻在Wx–1216處都為(CT)17．

2．2 22種水稻SSII－3基因型分析

采用Bao等［7］設計的分子標記SSII-3 M1檢測SSII-3，GC型SSII-3 PCR產物有分子量為544 bp條帶，TT型SSII-3 PCR產物有分子量為828 bp條帶．22種水稻檢測結果顯示，只有“紫香糯861”水稻的SSII-3基因型為GC型，其余21種水稻都屬TT型(圖4)．

圖4 SSII-3 M1對22種水稻SSII-3基因型檢測

2．3 22種水稻SBE3基因型的分析

采用Han等［8］設計的CAPS(Spe I)分子標記檢測SBE3，Ⅱ型SBE3 PCR產物可被Spe I酶切開，產生一條分子量為293 bp的條帶和一條分子量為217 bp的條帶，而Ⅰ型SBE3 PCR產物不能被Spe I酶切，分子量仍然為510 bp．22種水稻檢測結果顯示，只有“湘晴”、“R44”和“繁14”為Ⅰ型，其余19種水稻都屬于Ⅱ型(圖5)．

2．4 22種水稻AGPiso基因型分析

利用田志喜等［9］報道的CAPS(Eco RI)類分子標記AGPiso M3檢測AGPiso，Ⅰ型PCR產物不能被Eco RI識別，片段大小為427 bp，Ⅱ型PCR產物能夠被酶切成316 bp和111 bp兩段．22種水稻檢測結果顯示，“紫香糯861”為AGPisoⅠ型，其余21個水稻品種為Ⅱ型AGPiso(圖6)．

圖5 22種水稻SBE3基因型檢測

圖6 AGPiso M3對22種水稻AGPiso基因型檢測

2．5 22種水稻SSIV－2基因型分析

Tian等［4］認為，SSIV-2對稻米糊化溫度具有影響的高相關性位點位于第1內含子的+437 bp處．根據該位點的差異，SSIV-2可以分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種基因型．本研究根據Ⅰ型和Ⅱ型SSIV-2在+437 bp處的差異建立了分子標記SSIV-2(+437)，并對22種水稻基因組DNA進行檢測．結果顯示，22種水稻都為Ⅰ型SSIV-2(圖7)．

圖7 SSIV-2(+437)對22種水稻Wx基因型檢測

2．6 22種水稻ISA基因型的分析

Tian等［4］認為，依據起始密碼子上游-1499和-1326處的不同核苷酸，將ISA分為兩種Ⅰ型和兩種Ⅱ型．-1499處是C為Ⅰ型，在–1326處無AT核苷酸插入為Ⅰ型．-1499處是G為Ⅱ型，在-1326處有AT插入為Ⅱ型．經過對ISA PCR產物測序結果顯示，22種水稻的ISA在-1499處都是Ⅰ型，而在-1326處都是Ⅱ型．

2．7 22種水稻AGPlar基因型分析

根據Tian等［4］報道，AGPlar對稻米直鏈淀粉含量有影響的高相關性核苷酸位點位于起始密碼子上游-1633處．根據這個位點核苷酸的差異，AGPlar可以分為兩種基因型．Ⅰ型在-1633處為C，Ⅱ型在-1633處為T，22種水稻AGPlar測序結果顯示，在-1633處都為T，因此，22種水稻AGPlar的基因型都為Ⅱ型．

2．8 22種水稻SSI基因型分析

Tian等［4］研究顯示，SSI對稻米直鏈淀粉含量產生影響的高相關性核苷酸位點在第4內含子的+3216處．根據這位點核苷酸差異，SSI可以分為兩種基因型．Ⅰ型在+3216處為T，Ⅱ型在+3216處為A，22種水稻測序結果發現，它們在SSI的+3216處都為A，由此表明，22種水稻SSI基因型都為Ⅱ型．

2．9 22種水稻SSIII－2基因型分析

在Tian等［4］報道中提出，位于SSIII-2起始密碼子上游-1078處的核苷酸差異構成了SSIII-2影響稻米直鏈淀粉含量的高相關性位點．根據這個位點核苷酸的差異，可以將SSIII-2分為兩種基因型．Ⅰ型在-1078處為T，Ⅱ型在該處為C，測序結果表明，22種水稻在-1078處都為C，它們的SSIII-2基因型都為Ⅱ型．

2．10 22種水稻PUL基因型分析

PUL對稻米直鏈淀粉含量產生影響的高相關性位點，是位于+855處的核苷酸［4］．根據這處位點核苷酸的差異，可以將PUL分為兩種基因型．Ⅰ型在+855為C，Ⅱ型在+855處為T，22種水稻測序結果表明，它們在+855處都為T，因此，它們的PUL基因型都屬于Ⅱ型．

3 討論

具有較低的直鏈淀粉含量(AC)、較高膠稠度(GC)及較低糊化溫度(GT)的稻米一般都具有較好食味品質．Tian等認為，含Ⅰ型AGPlar、PUL、SSI、SSIII-2的稻米，AC明顯比基因型為Ⅱ型的高;AGPiso、SBE3、ISA(-1326)基因型為Ⅰ型的GC明顯比基因型為Ⅱ型的GC低．GT一般用堿消值(ASV)表示，ASV與GT成反相關．含Ⅰ型ISA(–1499)和Ⅰ型SSIV-2稻米的堿消值高于Ⅱ型［4］．Bao等［7］對506種水稻品種SSII-3 GC/TT多態性分析發現，GC型水稻品種具有比較高的GT，而TT型水稻品種具有相對低的GT．根據Tian等［4］對不同食味品質基因型評價，在本研究使用的22種水稻中，“紫香糯861”水稻含有相對較多不良食味品質基因型．3種雜交稻:“寒優湘晴”、“秋優金豐”和“花優14”對應的父本，“湘晴”、“R44”和“繁14”的食味品質基因型比這3種雜交稻母本，“寒風A”、“秋風A”和“申9A”以及其他常規稻有欠缺．

Tian等［9］利用49個分子標記對64個品種的基因型分析結果表明，同一地方不同品種的食味品質基因型比較相似．據有關文獻報道［13］，在比較亞洲水稻品種Wx等位基因時發現，野生稻與栽培稻相比，栽培稻在長期的篩選過程中人們所喜愛的好的基因型被積累下來，然而，這一過程也導致栽培稻基因中喪失了很多核苷酸多態性．本研究對22個上海市重要水稻10個食味品質基因型分析結果發現，這22種水稻中，盡管有個別水稻有些基因不屬于優質食味品質基因型，但大多水稻品種都具有比較良好的食味品質基因型．這可能也是由于一些好的食味品質基因在長期的進化過程中人為地被篩選保留下來了．

Aryes等［12］研究認為，Wx第1內含子上游的CT重復數與稻米直鏈淀粉含量呈反相關，并提出CT重復越高，稻米直鏈淀粉含量越低的觀點．Tan等［14］分析了在74種水稻材料中的CT重復多態性及其與直鏈淀粉含量(AC)的關系，這些品種包括了秈稻，粳稻和普通野生稻，結果發現了8個(CT)n的等位基因．分析表明AC和CT重復有高相關性，高AC(＞22．0%)品種具有CT重復次數較少(n≤14)的等位基因;相反，除了糯米外，所有低或者中等AC的品種都有CT重復數較多(n≥16)的等位基因．本研究結果發現，這22種水稻品種有兩種CT重復的等位基因:(CT)17和(CT)18，18種水稻是(CT)17，4種水稻是(CT)18．這與Tan等［14］和Bao等［15］報道大多數水稻品種具有(CT)17的結果相符．本研究得到4個(CT)18水稻品種，“紫香糯861”為糯稻，另3個常規粳型水稻是“金豐”、“寶農34”和“銀香18”．

陸家安等［16］報道，“金豐”水稻食味超過韓國食味最優質的“一品稻”，在2000年就被列為上海市優質米推廣后備品系，參與了上海市政府提出三年優質米推廣計劃，成為優質米的推廣品種之一．江健等報道，“99-34”(“即寶農34”［17］)稻米蒸煮出的米飯軟而油亮，適口性好，可與日本越光大米相媲美，并且從大米的外觀、色澤，米飯的光澤、風味、軟硬、粘度等方面對包括“99-34”(“寶農34”)、“銀香18”、“青香軟粳”、“南粳46”、“秀水123”等7種水稻品種的品質進行打分投票，結果顯示“99-34”(“寶農34”)水稻名列第一，“銀香18”雖然不如“99-34”(“寶農34”)，但也比“青香軟粳”、“南粳46”和“秀水123”水稻好［18］．因此，認為“寶農34”，“金豐”和“銀香18”這3種水稻品種，比本研究選用的其他常規水稻品種可能具有相對更好的食味品質．據此推測，Wx 5′UTR-1216處的(CT)18基因型也可能是使稻米具有相對更好食味品質的重要位點．

軟米的米質介于糯性和一般稻米之間，蒸煮的米飯軟而不爛，甜潤爽口，膨化性好，富有彈性，冷后變硬和回生程度小，符合廣大人群的需求．經檢測22種水稻中有2種糯稻，20種粳稻，其中“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻與“南粳46”水稻一樣是軟米型粳稻．“南粳46”水稻是江蘇省培育品種［11］，“滬嘉香軟”、“青香軟粳”和“1013”水稻是上海市最近培育的軟米水稻新品系．這表明目前上海市常規水稻的類型也已經較為全面和豐富．

［1］LITTLE R，HILDER G，DAWSON E．Differential effect of dilute alkali on 25 varieties of milled white rice［J］．Cereal Chem，1958，35(2):111-126．

［2］CAGARMPANG G B，PEREZ C M，JULIANO B O．A gel consistency test for eating quality of rice［J］．Sci Food Agric，1973，24(12):1589-1594．

［3］JULIANO B O．Rice chemistry and technology［M］．2nd ed．Saint Paul:American Association of Cereal Chemists，1985．

［4］TIAN Z X，QIAN Q，LIN Q，et al．Allelic diversities in rice starch biosynthesis lead to a diverse array of rice eating and cooking qualities［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(51):21760-21765．

［5］孫華欽，田潔，鄭家奎，等．糯稻和非糯稻蠟質基因的新STS分子標記［J］．應用與環境生物學報，2006，12(4):461-463．

［6］蔡秀玲，劉巧泉，湯述翥，等．用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標記［J］．植物生理與分子生物學學報，2002，28(2):137-144．

［7］BAO J S，CORKE H，SUN M．Nucleotide diversity in starch synthase IIa and validation of single nucleotide polymorphisms in relation to starch gelatinization temperature and other physicochemical properties in rice(Oryza sativa L．)［J］．Theor Appl Genet，2006，113(7):1171-1183．

［8］HAN Y P，XU M L，LIU X Y，et al．Genes coding for starch branching enzymes are major contribution to starch viscosity characteristics in Waxy rice(Oryza sativa L．)［J］．Plant Sci，2004，166(2):357-364．

［9］TIAN Z X，YAN C J，QIAN Q，et al．Development of gene-tagged molecular markers for starch synthesis-related genes in rice［J］．Chinese Sci Bull，2010，55(26):2591-2601．

［10］郭亮，徐申中，張建忠，等．聚合蠟質和抗條紋葉枯病基因水稻的分子標記輔助選擇［J］．西北植物學報，2011，31(8):1537-1542．

［11］WANG CL，ZHANG Y D，ZHU Z，et al．Development of a New Japonica Rice Variety Nan-jing 46 with Good Eating Qualityby Marker Assisted Selection［J］．分子植物育種，2009，7(6):1070-1076．

［12］ARYESN M，MCC L A M，LATKIN PD，et al．Microsatellites and a single-nucleotide polymorphism differentiate apparent amylase classes in an extended pedigree of USrice germ plasm［J］．Theor Appl Genet，1997，94(6-7):773-781．

［13］MIKAMI I，UWATOKO N，IKEDA Y，et al．Allelic diversification at the wx locus in landraces of Asian rice［J］．Theor Appl Genet，2008，116(7):979-989．

［14］TAN Y F，ZHANG Q F．Correlation of simple sequence repeat(SSR)variants in the leader sequence of the wx gene with amylose content of the grain in rice［J］．Acta bot sinica，2001，43(2):146-150．

［15］BAO J S，CORKE H，SUN M．Microsatellites in starch-synthesizing genes in relation to starch physicochemical properties in waxy rice(Oryza sativa L．)［J］．Theor Appl Genet，2002，105(6-7):898-905．

［16］陸家安，萬常照，侯根寶，等．優質、高產晚粳良種“金豐”的選育及其特性［J］．上海農業學報，2004，20(2):31-35．

［17］盛華芳，王一瑜，徐福良，等．優質晚粳“寶農34”的選育與栽培［J］．上海農業學報，2009，25(4):136-139．

［18］江健，金秀華，蘇瑞芳，等．2010年奉賢區優質水稻品種比較試驗初報［J］．上海農業科技，2011(4):28-29．