6A，6A'-苯胺-6B，6B'-硒橋聯-β-CD 底物的特異性

呂紹武，呂冰聰，宗 慧，陶 進，王宏齡

(1.吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室，長春130012;2.玉米深加工國家工程研究中心，長春130033)

谷胱甘肽過氧化物酶(gluathione peroxidase，GPx，EC.1.11.1.9)在生物體內具有維持體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)平衡的作用，對預防和治療白內障、心血管病及癌癥等有明顯效果［1］.由于天然GPx穩定性較差，且其催化中心硒代半胱氨酸(Sec)由終止密碼子UGA編碼，不易用基因工程方法量產而限制了其應用，因此GPx模擬物成為抗氧化治療的研究熱點［2-3］.

本文基于調節催化基團硒(Se)氧化還原環境和引入底物結合部位的原理，設計合成了6A，6A'-二苯胺-6B，6B'-二硒橋聯-β-CD(6-AnSeCD)分子［4］，并測定了6-AnSeCD 催化谷胱甘肽(GSH)還原不同結構氫過氧化物的GPx活力，分析了6-AnSeCD穩態動力學常數的差異，確定6-AnSeCD的首選底物為枯烯過氧化氫(CumOOH).

1 實驗

1.1 試劑與儀器

β-環糊精(β-CD)購自上海惠世生化試劑有限公司，經蒸餾水重結晶3次，120℃真空干燥12 h備用;硼氫化鈉(NaBH4)、谷胱甘肽還原酶、還原型輔酶(NADPH)、還原型谷胱甘肽(GSH)、硒粉(Se)、1，3-間苯磺酰氯(1，3-benzenedisulfonyl chloride)、叔丁基過氧化氫(t-BuOOH)、枯烯過氧化氫(CumOOH)和依布硒啉(Ebselen)均購自美國Sigma公司;雙氧水購自英國Alfa Aesar公司;DEAE-52購自英國Whatman公司;Sephadex G-25購自瑞典Pharmacia公司;其他試劑均為購自北京化學試劑廠的分析純試劑.

240-DS型元素分析儀(美國 Perkin-Elmer公司);IFS66型傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司);UNITY-400型核磁共振儀(美國Varian公司);ESCALAB MKⅡ型 X-ray光電子能譜儀(英國VG公司);ALPHAL-2型凍干機(德國 Christ公司);UV-2550型分光光度計(日本Shimadu公司).

1.2 6-AnSeCD的合成與表征

按照文獻［4］合成6-AnSeCD，表征結果與文獻［4］報道一致.

1.3 GPx活力測定及穩態動力學分析

采用雙酶體系，按Wilson方法［5］測定模擬物的GPx活力.向反應池中加入緩沖液、GSH溶液、GSH還原酶和模擬物，37℃保溫7 min后先加入NADPH，再加入氫過氧化物啟動反應.用含有體積分數為0.2%TritonX-100的PBS溶解有機氫過氧化物(t-BuOOH，CumOOH)，模擬物的活力由在340 nm(εNADPH=6 220 L/(mol·cm))處NADPH光吸收值的降低確定.以緩沖溶液代替模擬物為空白以消除非酶促反應.酶活力單位定義為37℃每分鐘氧化1 μmol NADPH所需的模擬物量.動力學分析是保持一種底物的濃度不變，改變另一種底物的濃度，測定NADPH在340 nm處光吸收值的變化確定其初速度.

2 結果與討論

2.16 -AnSeCD的GPx活力

表1列出了6-AnSeCD與其他模擬物催化GSH還原氫過氧化物的GPx活力比較結果.由表1可見，6-AnSeCD和6-SeCD催化GSH還原H2O2的GPx活力分別為6.1 min-1和4.2 min-1，高于Ebselen的GPx活力(1.9 min-1).這是由于Ebselen分子缺少有效的底物識別及結合作用，而在6-AnSeCD和6-SeCD的分子結構中，β-CD的疏水空腔能結合形狀和大小匹配的底物，因此6-AnSeCD和6-SeCD與Ebselen相比具有更好的底物識別及結合能力，具有較高的GPx活力.

表1 6-AnSeCD與其他模擬物催化GSH還原氫過氧化物的GPx活力比較(min-1)Table 1 Comparison between GPx activities of 6-AnTeCD-catalyzed reduction of hydroperoxides by GSH and other mimics(min-1)

6-AnSeCD催化GSH還原H2O2，t-BuOOH，CumOOH時的GPx活力分別為6.1，8.6，13.2 min-1，均高于6-SeCD催化GSH還原相應的氫過氧化物.該結果可用Wilson理論［5］解釋.催化巰基化合物還原ROOH的催化機理如圖1所示，該催化機理包括氧化和巰基還原兩個過程.由圖1可見，N原子接近活性部位的Se原子可穩定硒氫基的催化中間體，從而增加二硒化合物的GPx活力.6-AnSeCD對不同結構的ROOH顯示出不同的底物特異性，其催化上述3種氫過氧化物的GPx活力順序為CumOOH＞t-BuOOH＞H2O2.

圖1 Wilson提出的催化機理Fig.1 Catalytic mechanism proposed by Wilson

2.2 6-AnSeCD的穩態動力學分析

固定一種底物濃度，改變另一種底物濃度，測定不同條件下的反應初速度.初速度與濃度的雙倒數曲線如圖2所示，為一系列平行線，表明6-AnSeCD的催化機制與天然GPx類似，均為乒乓機制.

圖2 6-AnSeCD催化谷胱甘肽還原過氧化氫的雙倒數曲線Fig.2 Double-reciprocal plots for the reduction of H2O2by GSH catalyzed by 6-AnSeCD

比較動力學參數可確定模擬物對不同底物動力學行為的差異，本文根據該反應的穩態動力學方程計算了模擬物的動力學常數，結果列于表2.該反應的穩態動力學方程為

其中:v0為反應初速度;c(E)0為GPx模擬物的濃度;kmax為假一級反應速度常數;KROOH和KGSH分別為ROOH和GSH的米氏常數(Km).

表2 6-AnSeCD的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of the 6-AnSeCD

由表2可見，對于同種巰基底物(GSH)，kmax值的變化順序為kmax(CumOOH)＞kmax(t-BuOOH)＞kmax(H2O2).由于kmax值一般指該反應的最大kcat值［7］，因此每秒鐘每個酶分子轉換ROOH底物分子數的順序為CumOOH＞t-BuOOH＞H2O2，表明6-AnSeCD可高效轉化CumOOH;Km值的變化順序為KCumOOH＜Kt-BuOOH＜KH2O2，該結果可用尺寸匹配理論解釋［8］，即CumOOH的分子形狀和大小與β-CD的疏水空腔匹配，因此結合能力最強，t-BuOOH的分子中側鏈基團較多，產生的空間位阻影響了匹配程度，因此結合能力較強，H2O2分子依靠自由運動與疏水空腔結合，因此結合能力最弱，該結果與文獻［9］結果相符;二級反應速率常數k(k=kmax/KROOH)的變化順序為 kCumOOH＞kt-BuOOH＞kH2O2，表明6-AnSeCD對不同的ROOH底物具有不同的結合能力和底物特異性.

綜上所述，本文可得如下結論:6-AnSeCD還原CumOOH的GPx活力最高;6-AnSeCD的催化機制為乒乓機制;CumOOH為6-AnSeCD的最適底物.

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