大鼠局灶性腦缺血后神經功能評分與腦梗死體積相關性分析

王榮亮 劉小蒙 張 營 吉訓明 羅玉敏

(首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究室 北京市老年病醫療研究中心，北京 100053)

線栓阻斷法制作的大鼠局灶性大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是研究腦缺血再灌注最為常用的模型。損傷后腦梗死體積及神經功能損傷的評定是目前判定此模型成功的關鍵，也是研究腦缺血治療藥物及方法的主要觀察指標。然而，大鼠腦缺血再灌注后的腦梗死體積和神經功能缺損程度是否存在相關性，是否可以通過神經功能缺損程度的評定來評判腦梗死的嚴重程度，目前報道的不多［1-2］。

本研究的目的在于探討線栓阻斷法制作的局灶性腦缺血再灌注模型大鼠的神經功能評分與腦梗死體積相對百分比的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠20只，體質量為280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證:SCXK(京)2009－0001。隨機分籠飼養，維持室溫20～22℃，術前禁食，但自由進水。通過隨機數字表以簡單隨機化方法將大鼠按不同時間點分為5 組:缺血再灌注后 24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 組，每組4只。將頭端直徑為0.25 mm的線栓浸泡在肝素中備用。本實驗的大鼠大腦中動脈阻塞缺血再灌注模型制作方法參考Zea Longa法［3］，稍作改變，具體操作如下:大鼠稱體質量后，用體積分數4% ～5%的恩氟烷誘導麻醉，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉。將大鼠仰臥于手術臺上，取頸部正中切口，小心分離皮下脂肪和肌肉，右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA);分離ECA主干，鈍性分離出甲狀腺動脈和枕動脈，并電灼切斷。在CCA分叉處遠端約1 cm處結扎、電灼、切斷ECA，用動脈夾臨時夾閉CCA和ICA，用眼科剪在ECA殘端剪一切口，插入線栓，結扎縫合線，松開ICA動脈夾，緩緩推動線栓進入ICA入顱動脈支。線栓穿過距ICA和ECA分叉處約20 mm左右，有阻力感時放開CCA動脈夾，結扎CCA分叉處縫合線，縫合皮膚。缺血2 h后，再次麻醉大鼠，打開頸部切口，將線栓拔出，電凝ECA殘端后縫合頸部切口，即完成大鼠腦缺血2 h再灌注損傷模型。

1.2 神經功能評分

用以下三種評分方法分別在腦缺血再灌注24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 后進行神經功能評分。

(1)Longa評分法［3］評分標準為:采用 Longa等推薦的5分法，并稍作改進，對大鼠神經功能進行評分，0分:正常;1分:腦缺血對側的前肢不能伸展;2分:腦缺血對側的前肢屈曲;3分:實驗動物向缺血對側輕度轉圈;4分:實驗動物明顯向缺血對側轉圈;5分:實驗動物爬行時向缺血對側傾倒。

(2)前肢踩空試驗(forelimb placing test)［4-5］:反映實驗動物的視覺、觸覺以及前肢對感覺及運動的整合能力。將由正方形網格(3 cm×3 cm)組成的1米長的架子放置在離地面1米的高度，讓大鼠在1 min之內由架子一端爬過另一端，爬行過程中前肢掉入網格里1次記為1分。計算1 min之內，爬行中大鼠腦缺血對側前肢掉入網格里的總次數。

(3)Ludmila Belayev 12分評分法［6］:1)姿勢反射試驗，即提尾懸空試驗:無明顯神經功能缺失為0分，梗死對側肢體屈曲為1分，側推試驗陽性為2分。2)肢體放置試驗:①視覺亞實驗，實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，讓動物位于桌子前方，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近，大鼠正常反應為前肢即抓向桌面，損傷大鼠則表現為肢體反應延遲。0分:動物肢體放置反應正常;1分:反應延遲但不超過2 s;2分:反應延遲且超過2 s。側方刺激，讓動物位于桌子側方，實驗檢測方法及評分標準同前方刺激。②觸覺亞實驗，將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，用其前爪背側輕觸桌面，刺激深度僅達皮膚和毛發，動物反應及評分同視覺亞試驗，觸覺刺激同樣分前方和側方刺激。③本體覺亞實驗，操作及評分同觸覺亞實驗，僅刺激深度不同，本體覺亞實驗給予前爪較大壓力，刺激深達肌肉及關節。該亞實驗只有前方刺激。動物前肢放置試驗總分范圍為0～10分，功能損傷越重，得分越高。

1.3 HE染色測定腦梗死體積

各組大鼠分別在腦缺血2 h再灌注24 h、3 d、7 d、14 d、30 d后，10%水合氯醛腹腔麻醉，右心室快速灌注肝素化磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)并用4%多聚甲醛進行固定，斷頭取腦，置4%多聚甲醛中后固定48 h后放入模具，于視交叉處沿冠狀切片，向前囟方向切2張切片，向小腦方向切3張切片，每片厚約2 mm，石蠟包埋、切片。每片腦組織做HE染色，數碼相機拍攝，使用Image-Pm Plus 6.0圖像分析系統計算腦梗死體積。大鼠腦梗死百分比=(正常側大腦半球體積－梗死側非梗死區大腦半球的體積)/正常側大腦半球體積%=［(S1'+S2'+…+Sn')H-(S1+S2+…+Sn)H］/(S1'+S2'+…+Sn')H%［8］，Sn'表示每片正常腦組織面積，Sn表示梗死側非梗死區每片腦組織面積，H表示每片厚度。

1.4 統計學方法

利用SPSS 16.0軟件進行神經功能評分與腦梗死體積相對百分比分析處理，計量數據用均數±標準差(x ±s)表示。組間比較用One-way ANOVA，用Pearson相關系數描述神經功能評分與腦梗死體積相對百分比的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死體積與神經功能缺失變化趨勢

線栓法制作局灶性腦缺血再灌注模型的大鼠在腦缺血再灌注后24 h到30 d，三種神經功能評分均有所降低(Longa 5分法從2.5±0.58降到1.25±0.5;前肢踩空試驗從5.5±1.92降到3.25±1.26;Ludmila Belayev 12分法從6±1.41降到2.75±1.89)，但腦梗死體積相對百分比降低的趨勢很弱(從腦缺血再灌注后24 h的51.9±4.09到7 d的50.89±3.62，再到 30 d 的 44.63±2.74)(圖 1)，比較各組之間腦梗死體積相對百分比，差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。在三種神經功能評分中，缺血再灌注后7 d組與30 d組的前肢踩空試驗及Ludmila Belayev 12的評分結果分別相比較，差異有統計學意義(P＜0.05，表 1、圖 2、3)。

圖1 不同時間點HE染色結果Fig.1 HE staining at different time points

表1 各時間點大鼠腦梗死體積相對百分比及神經功能評分結果Tab.1 Comparison of infarct volume and neurological deficit scores(±s，n=4)

表1 各時間點大鼠腦梗死體積相對百分比及神經功能評分結果Tab.1 Comparison of infarct volume and neurological deficit scores(±s，n=4)

*P＜0.05 vs 7 d group.

Item 24 h 3 d 7 d 14 d 30 d P Infarct volume/% 51.90±4.09 42.70±10.48 50.89±3.62 43.92±9.63 44.63±2.74 0.248 Longa 2.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50 1.50±0.58 1.25±0.50 0.056 Forelimb placing test 5.50±1.92 5.50±1.74 6.50±1.00 5.50±0.58 3.25±1.26* 0.032 Ludmila Belayev 12 6.00±1.41 5.75±2.06 7.00±2.16 6.00±1.41 2.75±1.89* 0.033

2.2 腦梗死體積與神經功能缺失相關性分析

在神經功能評分與腦梗死體積相關性分析中，缺血再灌注后3 d組Ludmila Belayev 12分法評分結果與腦梗死體積相對百分比呈非常顯著相關性(r=0.991，P＜0.01);缺血再灌注后 30 d組 Ludmila Belayev 12分法評分與腦梗死體積相對百分比呈顯著相關性(r=0.951，P=0.049)。其余各組在各時間點與三種神經功能缺失評分均無相關性。

3 討論

神經功能缺失評分作為中風的一項終點指標，越來越受到醫生和研究人員的重視。在臨床前研究中，應用神經功能缺失評分對動物模型進行評價，如運動功能、本體感覺、視覺功能等，是判斷模型建立成功的重要依據，也是藥物研究中觀察的最重要指標之一。國際中風治療臨床前研究指南(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR)(2009)指出［7］:在腦缺血藥物研究中應選擇多重指標，評價應包括組織學和行為學的結果;且無論組織學還是行為學的研究都應包括中風后兩到3周或更長時間中獲得的數據。在臨床神經功能損傷評分中，往往會綜合評價神經功能多方面的損傷情況。如美國國立衛生院神經功能缺損評分(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)，要求對整體意識水平、感覺、視覺、運動、共濟等方面進行綜合評價［8-9］。目前評定腦缺血動物神經功能和行為的方法都有所提高，但是依然存在問題。如有些研究往往偏于運動功能，忽視了感覺功能，不能全面的反應神經損傷程度［10］。在神經功能缺失評分與梗死體積相關性方面已有一些研究，但觀察時間持續較短［2］，采用的神經功能評分方法也不全面［11］。本實驗采用三種神經功能缺失評分法對大鼠腦缺血再灌注后的 24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 五個時間點進行功能評價和組織學損傷之間的相關性研究，相對全面地分析大鼠MCAO后遠期組織變化與功能變化趨勢。

Wahl等［12］利用大腦中動脈電凝法制備大鼠腦缺血模型，并評價模型的梗死體積和神經功能，研究結果表明，神經功能損傷和組織學檢查相關性不明顯。在最近的研究中，Chauveau等［13］用核磁共振成像及TTC染色檢測大鼠腦梗死體積，結果顯示缺血再灌注后24 h內神經功能缺失評分與腦梗死體積無相關性。同樣的情況亦出現在本實驗中，大鼠腦缺血再灌注后24 h組的三種神經功能評分與梗死體積均沒有相關性，并且隨著時間的延長，神經功能評分逐漸改善，但梗死體積變化不大。以上研究均表明大鼠運動功能的改善，并非是梗死損傷減弱的結果。

本研究結果表明，三種評分方法總的變化趨勢是隨時間延長功能逐漸改善。前肢踩空實驗和Ludmila Belayev 12分評分法能較全面反映損傷后的運動、感覺及反射情況，其變化趨勢是大鼠腦缺血再灌注后3 d神經功能有所好轉，7 d稍有惡化，14 d及30 d評分大幅度降低，神經功能出現明顯好轉。前肢踩空實驗和Ludmila Belayev 12分評分法在大鼠腦缺血再灌注后第7 d和30 d差異有統計學意義，各組之間Longa評分法差異無統計學意義。第3 d功能好轉的原因可能是由于手術造成的梗死之外的損傷及水腫逐漸消除，此時Ludmila Belayev 12分法評分結果與腦梗死體積呈顯著相關性。腦缺血再灌注后第7 d神經功能惡化原因可能是遲發型的神經元損傷(主要是白質軸突損傷)及再發性水腫引起的，14 d和30 d的功能恢復表明大鼠的大腦中動脈主干阻塞不像人類那樣產生持續的偏癱和偏身感覺缺失，這可能和大鼠的運動和感覺皮質更為原始有關，也可能是因為嚙齒類動物自身神經再生修復性強。Fisher等［7］提出，一些功能評價方法在動物腦梗死后期均有自發性好轉傾向，因為大多數動物模型是年輕健康的動物制作的，這種情況在人類中也有發生，但是會弱很多。

雖然本研究監測了MCAO后遠期神經功能，但也有自身的缺陷。實驗中各組中的動物數量太少，存在驗證效能偏低的情況，導致陰性結果存疑的可能性。并且實驗過程中并未進行腦血流的動態檢測或者使用影像學方法測定其梗死部位，在統計HE染色后的梗死統計時并未依據梗死部位進行具體分析。另外，本研究顯示Ludmila Belayev 12分評分法只能在某些時間點和梗死體積相關(缺血再灌注后3 d及30 d)，因此仍然需要尋找新的評分方法或者改良之后的評分方法，使之更貼切的反應臨床表現。

為了更好的反應腦組織的損傷程度，提高神經功能的準確性，在制作模型的過程中可以考慮以下幾個因素:①依靠動態檢測和影像學輔助綜合評價。可將神經功能缺損評分、經顱多普勒及影像學等檢查(如頭顱CT、MRI、PET等)結合在一起來判定，這樣可使評判結果更客觀。也可應用激光多普勒血流測定儀(laser doppler flowmetry，LDF)在造模期間進行血流監測［14-16］;另外，MRI具有空間分辨率高的明顯優勢，而且能夠準確定位活體缺血發生的部位，能夠在相同神經功能評分情況下區分缺血損傷的具體部位，依此為依據可進一步提高評分的準確性［13，17］。②實驗動物種屬選擇對神經功能評分的影響［18］。Walberer等［19］發現再灌注對不同鼠種(Wistar和SD)能夠產生不同的效應，再灌注能夠使SD大鼠腦缺血體積明顯減小。Encarnacion等［20］研究表明，SD大鼠的腦梗死的體積與血流阻斷的時間相關，而Wistar則與之不相關。③對梗死腦組織不同的部位進行相關性分析。大鼠大腦中動脈供應大鼠皮質的側面和各種皮質下結構，特別是尾狀核殼核，這些皮質和紋狀體結構參與感覺和運動功能。Zansinger等［21］制作SD大鼠90 min MCAO腦缺血再灌注損傷模型，每天進行神經行為學評分，缺血后一周用HE染色觀察腦皮質和基底節梗死形態，結果發現神經功能評分與缺血后2 d后皮質梗死體積顯著相關，缺血后3 d后與整個梗死體積顯著相關。④腦梗死部位對神經功能評分的影響。He等［22］發現在一部分線栓未能經頸內動脈足夠深入以阻斷大腦中動脈血流時，由于頸內動脈的分支脈絡膜前動脈被阻塞也能夠引起神經功能的改變，此時神經功能評分的可靠性受到干擾。同樣為頸內動脈分支的下丘腦動脈供血區梗死表現為無或有輕度姿勢反射異常。而包含有內囊的分支脈絡膜前動脈供血區梗死能夠引起與梗死體積不相匹配的功能缺陷。也就是說除了皮質損害，重要的皮質下結構(尤其是纖維傳導束所經過的結構)受損同樣能夠出現神經功能的異常。因此，對腦缺血受累部位的準確定位顯得尤為重要。評價大腦不同部位的損傷與各種神經功能損傷間的相關性，將成為一個重要的研究方向［23-25］。

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