比較高碘酸-雪夫與雙花扁豆凝集素反應標記的小鼠蛻膜自然殺傷細胞

路 欣 許 晴 翁 靜

(1.首都醫科大學基礎醫學教學示范中心形態學實驗室，北京100069;2.首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京100069;3.首都醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，北京100069)

妊娠過程中，母體通常情況下不排斥帶有父源性成分的胚胎，而是“允許”其“種植”并生長發育，對于這一特殊的免疫現象，盡管已有大量的研究，但仍然沒有得到肯定的解答。目前認為正常妊娠時，在母體-胚胎接觸面上所具有的免疫特殊性，與激素、細胞因子以及免疫調節細胞密切相關［1］。在母體與胚胎直接接觸的蛻膜，有大量的免疫相關細胞，其中自然殺傷細胞(natual killer cell，NK)是最為主要的一類細胞。子宮NK細胞類似于僅占外周血中NK細胞總數10%的CD56brightCD16-NK細胞，表現為弱的細胞毒性，其功能的發揮以產生細胞因子來實現［2］。

在人類分泌期的子宮內膜也有NK細胞，但有研究［3-4］顯示，非妊娠和妊娠后存在的子宮自然殺傷細胞在表面標志、分泌的活性物質以及可能的功能等很多方面有一定差異，所以以子宮內膜自然殺傷(endometrial NK，eNK)細胞和蛻膜自然殺傷(decidual NK，dNK)細胞分別描述更為科學。在小鼠，dNK細胞于妊娠期出現在子宮，典型的細胞以含有經淀粉酶消化后高碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff)陽性反應顆粒為特征［5］。但是對于無顆粒的不典型dNK細胞，PAS不能很好地顯示。有研究［6］顯示雙花扁豆凝集素(Dolichos Bifows Agglutinin，DBA)可以高選擇性地與糖復合物末端的N-乙酰-D-半乳糖胺(N-acetyl-D-galactosamine)結合，在小鼠子宮僅與dNK細胞膜性結構反應，是繼PAS法之后又一種標記小鼠dNK細胞的手段。

本文分別采用PAS、DBA以及DBA加PAS雙重標記顯示dNK細胞，比較不同方法的差異。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

昆明系成年小白鼠，7～10周齡，體質量25 g，由首都醫科大學實驗動物中心提供［動物許可證號:SCXK(京)2005－0006］。雌雄分籠飼養，飼養環境為自然光照，溫度20℃ ～26℃、濕度40% ～70%，自由取食。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求。分籠飼養的小鼠每晚5時按雌雄比2:1進行合籠，次日早晨8時檢查雌鼠陰道，發現陰栓當日記為妊娠第1天(Gd 1)。

取 Gd 1～3，Gd 4～6，Gd 7～9，Gd 10～13，Gd 14～16，Gd 17～19天小鼠各5只，頸椎脫臼法處死，取出妊娠子宮，Gd 10天以前保留胚胎，之后去除胚胎，但盡量保留胎盤和子宮的相對位置。包埋面取垂直于子宮長軸，鄰近胚胎植入部位。取厚度為4μm的連續切片，分別進行常規HE染色、PAS染色和DBA反應。

1.2 方法

1)PAS反應的主要步驟:切片經二甲苯脫蠟，乙醇下行入水;經唾液淀粉酶作用后，入0.5%高碘酸溶液，室溫氧化;洗滌后入雪夫試劑，室溫避光作用15 min;SO2水浸洗，蒸餾水洗滌;Ehrlich蘇木精復染核;經上行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2)生物素標記的雙花扁豆凝集素(bio-DBA)的組織化學反應的主要步驟:切片經二甲苯脫蠟入水;3%H2O2，去除內源性過氧化物酶;加bio-DBA(Sigma公司)，4℃過夜(陰性對照以PBS液代替bio-DBA);加帶有辣根過氧化物酶的卵白素，室溫，30 min;二氨基聯苯胺顯色2～5 min;自來水沖洗終止反應，蒸餾水洗，經上行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。每一步驟間經PBS充分洗滌。

3)DBA加PAS雙重反應:bio-DBA反應如上所述，DBA顯色后，入1%高碘酸溶液，其余操作同1.2.1所述。

1.3 結果判斷

PAS反應陽性結果表現為紫紅色;DBA陽性反應結果呈現棕黃色，細胞數量采用Leica Q500IW型圖像分析儀分析，每個樣本于40倍物鏡下隨機取5個不同視野，計數陽性細胞數，取同一妊娠時期每個高倍視野平均陽性數。

2 結果

2.1 小鼠子宮組織學結構

小鼠子宮自腔面向外可見內膜、肌層以及被覆其外的漿膜。在漿膜向子宮系膜延續的部位，形成一個在橫斷面上呈三角形的區域(即系膜三角區)，該部位主要在妊娠后，特別是在胚胎“種植”后細胞數明顯增多，改稱謂子宮腺細胞區(圖1A)。隨著胚胎的“種植”，子宮腔逐漸縮小直至消失。胎盤結構于妊娠第10天基本形成(圖1B)。自妊娠第3天起蛻膜中可見一些圓形細胞，胞質染色比較淺，有些細胞的胞質中可見一些細小的顆粒，這種細胞自妊娠第8天起大量出現于子宮腺細胞區(圖1C)。

2.2 dNK細胞形態特點、定位及數量變化

HE染色中圓形、胞質染色比較淺的含有顆粒的細胞PAS呈陽性反應，提示其為dNK細胞。典型的dNK細胞直徑約20μm，以胞質內含豐富的被染成紫紅色的PAS陽性顆粒為特點，而這些細胞在DBA反應時，細胞膜、顆粒膜以及細胞核膜均呈棕黃色(圖2)。

利用PAS和DBA標記法，在未孕(動情周期各期)小鼠子宮內膜中未顯示出有典型的dNK細胞。DBA標本上，妊娠第3天即可在內膜中發現體積較小，但細胞膜和細胞核膜呈棕黃色的陽性反應細胞，胞質中沒有明顯顆粒;而連續切片PAS反應標本，相同部位的細胞則未見明顯陽性反應(圖3)。妊娠第10天以前的標本上，DBA陽性細胞多于PAS陽性細胞。而隨著dNK細胞中陽性顆粒的逐漸增多，基蛻膜和子宮腺細胞區中兩種標記顯示的陽性細胞數相對一致。對高倍視野下2種方法標記的陽性細胞的計數見表1。

DBA反應后再進行PAS反應，即雙重標記顯示，大部分dNK細胞的胞膜、細胞核膜呈棕黃色，胞質中含有紫紅色和棕黃色2種顏色的顆粒;妊娠第8天以后的標本上，可見少量細胞的顆粒僅呈現PAS陽性(圖4)。

表1 PAS和DBA標記不同妊娠時間陽性細胞分布計數(平均每高倍視野細胞數)Tab.1 The number of PAS/DBA positive cells at different pregnant time(avery cell count per high power field)

圖4 妊娠小鼠子宮，DBA加PAS雙重反應Fig.4 Pregnant uteri of mice，PAS/DBA double reactions protocol

3 討論

DBA高選擇性地與N-乙酰-D-半乳糖胺結合，盡管目前還不清楚DBA結合的半乳糖胺的功能意義，但因其僅與dNK細胞膜及顆粒膜結合，而與外周NK細胞以及子宮中其他淋巴細胞不反應，正在成為繼PAS反應之后又一種標記小鼠dNK細胞的手段［6-7］。

本實驗結果表明PAS和雙花扁豆凝集素組織化學法均可以標記典型的dNK細胞。2種標記方法同時應用時dNK細胞的細胞膜、細胞核膜和顆粒膜呈現DBA陽性，而顆粒呈紫紅色PAS陽性反應。兩種方法存在一些不同:在妊娠早期(Gd3-Gd6)DBA可以顯示沒有顆粒的dNK細胞，因此計數的DBA陽性細胞數多于PAS染色的陽性細胞數。提示DBA標記在妊娠早期PAS陽性顆粒尚未出現的幼稚dNK細胞。

雙重標記的標本上，在妊娠第8天以后可見非常少量的細胞僅表現為PAS陽性，而DBA為陰性，這與早期DBA陽性而PAS染色陰性的結果正好相反。我們推測這種差異可能是由于dNK細胞起源差異。目前關于dNK細胞的起源還存在爭議:有人認為［8-9］dNK細胞可能源自淋巴器官以及外周血中的NK細胞;有學者［10］則提出dNK細胞源于子宮內膜基底層的前體細胞;還有學者［11］提出 dNK細胞可能是由eNK細胞增生并轉化而來。目前尚不能夠確定dNK細胞為單一來源。

總之，小鼠dNK細胞可以用PAS和DBA來顯示，以含有PAS陽性顆粒為特點。DBA因與dNK細胞的細胞膜、核膜及顆粒膜特異結合，而成為一種新的dNK細胞標志物，特別適用于妊娠早期。

［1］Veenstra van Nieuwenhoven A L，Heineman M J，Faas M M.The immunology of successful pregnancy［J］.Hum Reprod Update，2003，9(4):347-357.

［2］Cooper M A，Fehniger T A，Turner S C，et al.Human natural killer cells:a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright)subset［J］.Blood，2001，97(10):3146-3151.

［3］Manaster I，Mandelboim O. The unique properties of human NK cells in the uterine mucosa［J］.Placenta，2008，29(Suppl A):S60-66.

［4］Yagel S.The developmental role of natural killer cells at the fetal-maternal interface［J］.Am J Obstet Gynecol，2009，201(4):344-350.

［5］翁靜，諸定壽.妊娠小鼠子宮內出現的一類特殊細胞—顆粒子宮腺細胞［J］.生殖與避孕，1994，14(3):178-181.

［6］Paffaro V A Jr，Bizinotto M C，Joazeiro P P，et al.Subset classification of mouse uterine natural killer cells by DBA lectin reactivity［J］.Placenta，2003，24(5):479-488.

［7］Zhang J H，Yamada A T，Croy B A.DBA-lectin reactivity defines natural killer cells that have homed to mouse decidua［J］.Placenta，2009，30(11):968-973.

［8］Di Santo J P.Natural killer cell developmental pathways:a question of balance［J］.Annu Rev Immunol，2006，24:257-286.

［9］Keskin D B，Allan D S，Rybalov B，et al.TGF beta promotes conversion ofperipheral blood NKcells into CD16-NK cells with similarities to decidual NK cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(9):3378-3383.

［10］Matsuura-Sawada R，Murakami T，Ozawa Y，et al.Reproduction of menstrual changes in transplanted human endometrial tissue in immunodeficient mice［J］.Hum Reprod，2005，20(6):1477-1484.

［11］Ho H N，Chao K H，Chen C K，et al.Activation status of T and NK cells in the endometrium throughout menstrual cycle and normal and abnormal early pregnancy［J］.Hum Immunol，1996，49(2):130-136.