火針干預脊髓損傷大鼠后血清對神經干細胞增殖分化的影響

李 巖 ，周 震 ，程素利 ，焦召華 ，陳 爽

（1.天津市公安醫院，天津 300042；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300150；3.天津中醫藥大學，天津 300193）

脊髓損傷（SCI）是交通事故、工礦事故及自然災害中常見的、嚴重危害人類健康的疾病，患者多出現損傷平面以下的感覺、運動障礙及尿便功能異常[1]。目前，國內外對于SCI的治療研究多集中在具有自我更新和定向分化潛能的神經干細胞（NSCs）上[2]。筆者在臨床應用火針多年，發現其對慢性SCI療效顯著[3]。前期研究也發現，火針對于脊髓神經細胞具有保護和抗凋亡作用[4-5]。但火針是否可能通過影響NSCs的增殖及分化產生作用尚不清楚。本課題應用細胞離體培養和血清藥理學的方法，就火針干預SCI大鼠后血清對脊髓NSCs增殖分化的影響進行相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 1）孕14 d昆明小鼠2只，清潔級。2）健康SD大鼠15只，體質量250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2007－0001，隨機分為假手術組、模型組與火針組，每組5只。

1.2 SCI模型動物建立 采用改良的Allen’s法[6]建立急性SCI動物模型。即采用20 g/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg體質量）腹腔注射將大鼠麻醉，取后正中切口，切除T9棘突、部分T10棘突和部分椎板，暴露硬膜，10 g的鐵錘從25 mm高處自由落下，撞擊硬膜囊，撞擊能量為25mm×10g，損傷直徑為2.5mm。與脊髓接觸的撞桿底端呈弧狀凹陷，直徑2.5 mm，與脊髓表面相吻合。撞擊成功的標志為大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢及身體回縮樣撲動，雙下肢呈弛緩性癱瘓。假手術組只做T9-T10椎板切除術。術后小心護理飼養，每天擠壓排尿3次，直到反射性膀胱排空建立。

1.3 干預方法 火針組選取大鼠脊髓損傷部位上下端的棘突間隙，相當于T7、T8及T11、T12部位，各旁開0.5 cm，共4個穴，8個針刺點，采用快針法火針針刺，每穴僅刺1針，深度為3～5 mm。造模后即行針刺1次，之后每隔24 h針刺1次，共治療3次。

1.4 目標血清制備 SD大鼠采血前禁食12 h，于第三次針刺后麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，分離血清。56℃滅活30min，220nm濾膜濾過除菌，-20℃保存備用。

1.5 神經干細胞的分離、培養及鑒定 取孕14 d昆明小鼠，無菌取出胎鼠，經D-Hanks液反復沖洗，解剖鏡下剝離皮膚、肌肉等組織，眼科剪剪碎脊髓，0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打，200目銅網過濾，離心，棄上清，加入含有 DMEM/F12、2%的 B27、20ng/mL堿性成纖維生長因子（bFGF）、20 ng/mL、表皮細胞生長因子（EGF）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的生長培養基，以5×105個/mL密度接種入25cm2培養瓶中，置入37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。此后每3 d半量換液1次，每7 d左右傳代1次。傳代培養純化的細胞經Nestin鑒定,顯示Nestin免疫反應陽性，表明所培養的細胞為神經干細胞。

1.6 NSCs增殖及生長狀態觀察 離心收集傳代培養8代的NSCs，吸管機械吹打,分離制備單細胞懸液,顯微鏡下計數。將細胞接種于12孔培養板,接種密度為 2×105個/mL。

各組NSCs按培養基中所含血清成分的不同共分3組，即假手術組、模型組及火針組。各組培養基均為含10%濃度SD大鼠不同血清成分的DMEM/F12基礎培養基（不含B27、rhEGF和rhbFGF），每4孔為同一血清成分培養液。

培養7 d后，擬分孔收集呈球形懸浮生長的細胞，再次機械分離制備單細胞懸液，顯微鏡下細胞計數。實驗重復3次。

1.7 NSCs誘導分化觀察 離心收集傳代培養8代呈球形懸浮生長的NSCs，吸管機械吹打分離成約含十幾個細胞的干細胞小球，分別接種于預先鋪有多聚賴氨酸蓋玻片的12孔培養板，培養基分別為上述3組含10%不同血清成分的培養基，每4孔為同一血清成分培養液，誘導NSCs分化。實驗重復3次。

1.8 免疫熒光染色 細胞貼壁培養7 d后，取各組蓋玻片上的細胞，經磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗后，4%多聚甲醛固定30 min，后接常規免疫熒光染色步驟。以β-tubllin標記分化的神經元，4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）標記細胞核，每張玻片采用雙盲法選擇5個視野計數神經元的比例。

1.9 統計方法 數據統計采用SPSS18.0軟件，進行單因素方差分析，兩兩間均值比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。

2 結果與分析

2.1 各組NSCs增殖及生長情況 在相差顯微鏡下，細胞接種于12孔培養板后，第1天，模型組細胞死亡較多，假手術組和火針組無明顯變化，細胞死亡尚少。各組形成了懸浮的、數量不等、大小不一的細胞團。3 d后，各組細胞多數呈球形且開始貼壁，并發出細小的突起。3組中，火針組細胞最多，開始貼壁時間最早，模型組細胞數最少，貼壁出現最晚。

2.2 各組NSCs分化情況 各組神經干細胞向神經元分化情況見表1和圖1。從表1可看出，3組NSCs均出現神經元分化，與模型組及假手術組相比，火針組神經元比例顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 神經干細胞培養7 d后各組NSC分化為神經元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

表1 神經干細胞培養7 d后各組NSC分化為神經元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

注：經多因素方差分析，與模型組相比，▲P＜0.05。

組別 n 神經元比例假手術組 5 25.28±1.03模型組 5 14.43±0.85火針組 5 28.22±1.21▲

圖1 不同血清作用7 d后，神經干細胞分化情況Fig.1 The differentiation of neural stem cells affected by the different blood serum after 7 days

3 討論

NSCs為中樞神經系統中的原始細胞，具有自我更新和多潛能分化的特性，可以分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[7-8]。自1992年Renyolds等[9]從成年小鼠紋狀體分離得到能在體外不斷增殖且可多向分化的NSCs，為中樞系統神經損傷的治療提供了新思路。

SCI的病理過程分為原發性損傷和繼發性損傷，其中神經細胞的病理性凋亡是繼發性損傷的關鍵病理基礎[10]，故適當誘導NSCs增殖并向神經元分化以彌補其損失，將成為SCI的潛在治療方法。

課題組在前期研究中證實，火針能減少SCI大鼠白介素-1β（IL-1β）、Caspase-3、p38MAPK 等凋亡相關蛋白的表達[10]，抑制凋亡細胞發生[11]，表明火針能抑制SCI大鼠炎癥反應及細胞凋亡，從而發揮神經保護作用。那么火針在抑制SCI大鼠細胞凋亡的同時，能否通過誘導NSCs增殖并向神經元分化以彌補凋亡的神經細胞，從而治療SCI？為探討此問題，課題組設計實施了本次研究。

本研究結果發現，火針干預后的SCI大鼠血清可促進離體狀態下的NSCs增殖，與假手術組及模型組相比細胞數目明顯增多；從神經元分化角度，火針組神經元分化比例增高，與另兩組比較差異具有統計學意義，表明火針干預后的SCI大鼠血清可促進NSCs增殖并可誘導其向神經元分化，這為火針治療SCI提供了部分實驗依據。但本實驗僅為離體細胞培養，火針能否對SCI大鼠內源性NSCs的增殖及向神經元分化產生作用及其作用機制，尚需進一步研究證實。

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[3]焦召華，李 巖，程素利，等.火針治療脊髓損傷后排尿困難13例[A].“針灸臨證經驗、醫案學術研討會”論文匯編，天津：2012.

[4]孫立明，李 巖，周 震，等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡細胞的影響[J].針灸臨床雜志.2011，27（1）：58－61.

[5]李 巖，程素利，周 震，等.火針對大鼠脊髓損傷后運動功能及BDNF 表達的影響[J].2012，29（6）：545-547.

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[10]Zhang N,Yin Y,Xu SJ,et al.Inflammation&apoptosis in spinal cord injury[J].Indian J Med Res.2012,135(3):287-296.

[11]孫立明，李 巖，周 震，等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關蛋白表達的影響[J].針灸臨床雜志.2010，26（12）：49－53.