滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦組織MLCP的調控作用*

胡懷強，周永紅，王樹才，曹秉振

（1.中國人民解放軍濟南軍區總醫院神經內科，濟南 250031；2.青島大學醫學院，青島 266071）

腦梗死后神經功能重塑的因素十分復雜，包括促進因素和抑制因素，能否有效解除抑制效應是中樞神經再生的關鍵[1]。Rho/ROCK信號通路在傳導髓磷脂相關抑制因子引起肌動蛋白細胞骨架重組、生長錐塌陷及抑制神經突起延伸過程中起著關鍵作用，已成為神經損傷發生的重要病理機制[2]。研究表明[3]，滋補肝腎復方可以誘導中樞神經系統產生有利的微環境促進神經再生，并顯著抑制Nogo-A表達，促進腦梗死后的神經發生。本研究首次通過給予滋補肝腎復方，觀察局灶性腦缺血模型大鼠梗死周圍腦組織中Rho/ROCK信號通路的關鍵因子肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的變化，探討滋補肝腎復方在腦梗死后神經再生、功能重塑中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物和分組 成年無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠60只，體質量250~300 g，由山東大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可號：SCXK（魯）20090001（山東省科學技術廳），實驗動物質量合格證號：魯動質號0005215（山東省實驗動物管理委員會），檢疫后備用，自由攝食進水。顆粒大鼠飼料，由濟南康大飼料與山東省實驗動物中心聯合生產，許可證號：魯飼準字364號。實驗過程中動物飼養及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規定。實驗動物購買后，在實驗室內預適應飼養1周，1周后按隨機數字表法隨機分為：正常對照組、假手術組、模型組和藥物組共4個大組，正常對照組、假手術組各10只，模型組和藥物組各20只。

1.2 藥物與試劑 滋補肝腎復方，主要藥物為何首烏、草決明、桑寄生、海馬、淫羊藿等，由山東魯信藥業有限公司生產，批號：2011040101，并按照成人劑量的20倍[9 g/（kg·d）]將其制成水溶液，濃度為0.9 g/mL（即10 mL/kg），置于4℃冰箱中備用。兔抗大鼠MLCP多克隆抗體，由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 大腦中動脈阻塞（MCAO）模型的制備 在Longa EZ等[4]報道的方法基礎上改良后行MCAO術制作局灶性腦缺血模型。MCAO模型成功的判斷標準采用Longa EZ評分標準[4]：0分，無神經缺損表現；1分，對側前爪不能充分伸展；2分，向外側轉圈；3分，行走時向對側傾倒；4分，不能行走，意識喪失。動物清醒后進行神經功能評分，1~3分者為納入標準，0分和4分者剔除。

1.4 給藥方法 于造模成功24 h后給藥，藥物組灌胃給予滋補肝腎復方水溶液10 mL/kg，余各對照組分別灌胃給予10 mL/kg的蒸餾水，每日1次，并于取材當天停藥。固體飼料和水自由攝取。

1.5 標本制備 在取材的各時間點，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注固定取腦，然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規脫水浸蠟包埋，于正中隆起水平在切片機上行4 μm連續冠狀切片。

1.6 腦梗死體積測定及比較 每組大鼠于造模1周神經功能缺損評分后迅速斷頭取腦，放入預冷的生理鹽水中，并在-20℃冰箱放置10 min，使腦微硬，去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩下的部分沿視交叉從前至后立即冠狀切成5片，經2%氯化三苯基四氮哇（TTC）37℃染色30 min后，用10%的甲醛緩沖液固定過夜。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統測量各層梗死灶面積并儲存，計算體積。計算公式V＝∑[（S1+S2）÷2×h]（V：總容積；S1，S2：每一切片上下兩面病灶面積；h：層面厚度）[5]，以梗死灶體積占全腦體積的百分率進行分析。

1.7 免疫組織化學染色 切片常規脫蠟至水。30%雙氧水（H2O2）1份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復1次，自然冷卻后用PBS（pH 7.2~7.6）洗滌2次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加兔抗大鼠MLCP多克隆抗體（1∶80），4 ℃過夜，PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20min。PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加試劑 SABC，37 ℃ 20 min，PBS（pH 7.2~7.6）洗5 min，4 次；二氨基聯苯胺（DAB）顯色：使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。免疫組織化學染色陰性對照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步驟同上，以檢查ROCK2免疫反應的特異性。

1.8 圖像分析 免疫組織化學染色方法檢測切片在統一放大倍數下，隨機選10個視野，運用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統進行分析，記錄平均陽性細胞數。

1.9 統計學方法 數據用SAS8.1版統計軟件進行分析，計量資料均采用均數±標準差（±s）表示，組間比較單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 滋補肝腎復方對MCAO大鼠神經功能的影響 根據Longa EZ評分標準對治療后各組MCAO大鼠的神經功能進行了評價，評價結果見表1。

表1 滋補肝腎復方對MCAO大鼠神經功能的影響（±s）Tab.1 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the the neural function of the MCAO rats（±s） 分

表1 滋補肝腎復方對MCAO大鼠神經功能的影響（±s）Tab.1 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the the neural function of the MCAO rats（±s） 分

注：與正常對照組比較，▲t=5.80，P＜0.01；治療后與模型組比較，△t=5.42，P＜0.01。

組別 n Longa EI評分正常對照組 5 0.00±0.00假手術組 5 0.00±0.00模型組 7 2.71±0.49藥物組 7 1.29±0.49▲△

應用Longa EZ評分標準對治療1周后的各組大鼠進行神經功能評分，藥物組的神經功能評分較較模型組降低，差異有顯著性意義，表明滋補肝腎復方可有效改善MCAO大鼠的神經功能缺損癥狀。

2.2 滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 通過TTC染色觀察了滋補肝腎復方對各組MCAO大鼠的腦梗死體積的影響，結果見表2。

表2 滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦梗死體積的影響（s）Tab.2 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the brain infarct volume of the MCAO rats（±s）%

表2 滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦梗死體積的影響（s）Tab.2 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the brain infarct volume of the MCAO rats（±s）%

注：與正常對照組比較，▲t＝20.81，P＜0.05；與模型組比較：△t＝7.43，P＜0.01。

組別 n 梗死體積正常對照組 5 0.00±0.00假手術組 5 0.00±0.00模型組 7 23.16±2.14藥物組 7 15.57±1.65▲△

TTC是一種水溶性鹽類物質，它可以與活細胞線粒體脫氫酶反應生成深紅色脂溶性物質，死亡細胞由于線粒體內脫氫酶失活而不顯色。即正常組織染成均勻的玫瑰紅色，而梗死灶呈白色。正常對照組及假手術組腦組織呈均勻紫紅色，沒有梗死灶。模型組腦切片上左側大腦半球有大面積蒼白梗死區，而藥物組平均梗死體積測定值明顯低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01），說明滋補肝腎復方可明顯減小血管閉塞后腦組織的梗死體積。

2.3 滋補肝腎復方對MCAO大鼠MLCP的影響 采用免疫組織化學方法觀察MCAO大鼠梗死腦組織周圍MLCP表達，結果見表3及圖1-4。

表3 滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦組織MLCP表達的影響（±s）Tab.3 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the expression of MLCP in brain tissue in rats with MCAO（±s）

表3 滋補肝腎復方對MCAO大鼠腦組織MLCP表達的影響（±s）Tab.3 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the expression of MLCP in brain tissue in rats with MCAO（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，P＜0.01。

組別 n 吸光度（A）正常對照組 5 5.01±0.85假手術組 5 5.16±2.08模型組 7 17.91±2.82藥物組 7 10.20±4.77*△

圖1 正常對照組（10×40）Fig.1 Normal control（10×40）

圖2 假手術組（10×40）Fig.2 Sham operation group（10×40）

圖3 模型組（10×40）Fig.3 Model group（10×40）

圖4 藥物組（10×40）Fig.4 Treatment group（10×40）

結果顯示，腦梗死后1周時正常對照組和假手術組大鼠腦內的MLCP呈低表達狀態，兩者之間差異無統計學意義。大鼠腦梗死后腦內的MLCP表達增高，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），說明腦梗死后神經再生抑制相關因子開始表達。藥物組與模型組比較顯示，藥物組大鼠腦組織中MLCP表達雖然較正常對照組增多，但較模型組明顯減少，兩者之間有差異有統計學意義（P＜0.05），說明滋補肝腎復方可抑制MLCP在腦梗死后的表達。

3 討論

近年來研究表明抑制因素在神經再生過程中扮演著更為重要的角色，迄今中樞神經系統髓磷脂相關的3種主要軸突再生抑制因子已被鑒定，包括Nogo、MAG、OMgp[5]。大量文獻資料表明這3種髓磷脂相關抑制因子完全依賴與NgR/P75NTR/Lingo-1膜受體復合物結合激活Rho/ROCK信號通路[6-7]。Rho/ROCK信號通路被稱為肌動蛋白細胞骨架的調節器，也是細胞形態異質性的調節器[8]。激活后的Rho/ROCK可以影響許多生物學行為，包括細胞骨架的組裝、轉錄因子的激活、細胞周期的調節等，在中樞神經系統中參與調節突觸可塑性。研究發現，在神經發育過程中，Rho/ROCK信號通路參與生長錐的塌陷、抑制軸突發展和短期包繞細胞體等[9]。Rho/ROCK通路參與從軸突生長抑制因子到生長錐的肌動蛋白細胞骨架信號換能過程[10]。因此，Rho/ROCK信號通路在傳導髓磷脂相關抑制因子引起肌動蛋白細胞骨架重組、生長錐塌陷及抑制神經突起延伸過程中起著關鍵作用，已成為神經損傷發生的重要病理機制[11]。由此可見，阻斷Rho/ROCK信號通路可促進軸突再生及神經功能恢復[12]。

MLCP是一種肌球蛋白限制的特異性去磷酸化Thr-18、Ser-19的磷酸酶，由38 kU催化亞單位（protein phosphatase 1c）、110~130 kU 調節亞單位（MBS或MYPT 1）和20 kU肌動蛋白結合亞單位組成。其調節亞單位MYPT 1接受Rho/ROCK的活化信號發生磷酸化修飾，導致MLCP失活[13]，從而失去對已磷酸化肌球蛋白的脫磷酸作用，使得胞漿內磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）水平增高，肌動—肌球蛋白交聯增加，從而影響肌動蛋白聚集和解聚過程，促進肌動蛋白微絲骨架的收縮與聚合，最終導致生長錐塌陷、回縮，軸突生長停止[14-15]。Rho激酶抑制劑可顯著降低移植細胞凋亡、增加細胞繁殖能力、促進神經發生[16]。

中醫認為，腦梗死的主要病機是機體在各種病理因素作用下，機體陰陽失調，肝腎陰精受損，風火痰氣血等病理產物旋而變生，在各種誘因作用下引發而致。其病機關鍵為肝腎陰虛，肝腎陰虛成于中風之先，是腦梗死發病的根本。中醫腦髓與中樞神經在解剖上具有同源性，肝腎與腦髓密切相關性，滋補肝腎使腎精充足，腦髓得養，神機得復，對維持腦內神經元的相對恒定，抗損傷修復機制中占主導地位，因此滋補肝腎是促進中樞神經再生的重要方法[17]。滋補肝腎復方是山東省名中醫藥專家王新陸教授所創，是臨床治療腦梗死的有效方劑，由何首烏、桑寄生、草決明、海馬、淫羊藿組成，此方針對腦梗死“肝腎陰虛為本”的病機特點而設，旨在滋補肝腎。方中諸藥合用，一則靶向明確，二則燮理陰陽，三則肝腎并補，四則峻緩適宜，并具有補中寓行，寓調于補，調補結合，滋而不膩的特點。研究結果表明，藥物組大鼠腦組織中MLCP表達雖然較正常對照組增多，但較模型組明顯減少，說明滋補肝腎復方可抑制MLCP在腦梗死后的表達。表明滋補肝腎復方可通過抑制神經生長負性調控因子的表達，而對腦梗死后的神經發生過程有促進作用。

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