急性酒精性肝線粒體損傷和肝MDA及SOD的變化

劉紅云，劉麗君，覃彩芹，田思思，李志萍

（1.湖北工程學(xué)院 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感432000；2.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感432000）

酒精性肝細(xì)胞線粒體損傷和脂質(zhì)過氧化在酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。線粒體機(jī)能障礙，尤其是線粒體解偶聯(lián)，引起線粒體原動(dòng)力降低，ATP損耗。損害的線粒體影響脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡，生物能運(yùn)行障礙，產(chǎn)生過多的活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)積聚和氧化應(yīng)激。線粒體機(jī)能障礙和／或解偶聯(lián)，通過線粒體膜的透化作用、ATP損耗、壞死、凋亡容易造成肝細(xì)胞死亡。防止線粒體損傷將是酒精肝等疾病有效的治療方法之一［1］。酒精可增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化和氧自由基的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激提升。Chari等發(fā)現(xiàn)酒精性肝硬化病人SOD、MDA等過氧化相關(guān)物質(zhì)有顯著變化，而非酒精性肝硬化病人無明顯變化［2］。本研究探討急性酒精性肝線粒體損傷和肝過氧化相關(guān)物質(zhì)SOD、MDA的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑

475mL／L酒精，1%詹納斯綠B染液，0.25 mol／L緩沖蔗糖溶液，0.34mol／L緩沖蔗糖溶液，10%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸，13mol／L蛋氨酸溶液，63μmol／L氮藍(lán)四唑溶液，40μmol／L核黃素溶液。以上試劑由湖北工程學(xué)院生科院實(shí)驗(yàn)中心藥庫提供的相關(guān)藥品配制而成。

1.2 儀器設(shè)備

800型低速離心機(jī)，龍岡醫(yī)療機(jī)械廠制造；TGL－20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司制造；顯微鏡用測(cè)微尺，上海第三光學(xué)儀器廠制造；722E型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司制造。

1.3 動(dòng)物分組建模

20只雄性昆明小白鼠，體重34～46g，由湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組10只。實(shí)驗(yàn)組按體重10 g／kg 475mL／L酒精一次性灌胃，對(duì)照組灌胃生理鹽水。灌胃后48h取肝作相關(guān)檢測(cè)。

1.4 線粒體分離

按肝細(xì)胞勻漿制備方法制備1g小鼠肝組織勻漿，差速離心，取純化的線粒體沉淀物涂片，1%詹納斯綠B染色，蓋片后油鏡下取2個(gè)視野取線粒體的最長和最寬處觀察測(cè)量線粒體長和寬，求平均值。

1.5 MDA、SOD檢測(cè)

MDA檢測(cè)：每只小鼠取肝組織0.3g勻漿、離心、沸水浴、再離心，取上清分別在450nm、532nm、600nm下比色，計(jì)算MDA含量。

SOD檢測(cè)：每只小鼠取肝組織0.3g冰浴勻漿、低溫離心，取上清加樣，光照培養(yǎng)顯色，在550nm波長下測(cè)吸光度，計(jì)算SOD活性單位。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，求P值，判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體分離結(jié)果

對(duì)照組肝線粒體平均長是3.31μm，實(shí)驗(yàn)組是4.63μm，兩者差異極顯著（P＜0.01）。對(duì)照組肝線粒體平均寬是0.72μm，實(shí)驗(yàn)組是0.92μm，兩者差異極顯著（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組肝線粒體變性，可見明顯的腫脹和斷裂，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組小鼠肝線粒體腫脹和斷裂（詹納斯綠B染色，數(shù)顯光鏡，×5500）

2.2 MDA、SOD檢測(cè)結(jié)果

MDA檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組平均肝MDA是0.74μmol／g，實(shí)驗(yàn)組是1.63μmol／g，兩者差異極顯著（P ＜0.01）。

SOD檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組平均肝SOD是8.37U／g，實(shí)驗(yàn)組是3.70U／g，兩者差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

氧化應(yīng)激與酒精性肝病等多種肝病及其發(fā)病機(jī)制有關(guān)。急慢性酒精中毒者，NADH產(chǎn)生過多觸發(fā)了線粒體呼吸鏈酶Ⅰ、Ⅲ，氧自由基、過氧、活性氧產(chǎn)生增多可能是線粒體和細(xì)胞氧化應(yīng)激及其損傷的主要原因。線粒體氧化應(yīng)激容易使乙醇或乙醛介導(dǎo)的線粒體膜滲透性改變和細(xì)胞凋亡。急慢性酒精中毒和膽汁性肝硬化線粒體氧化應(yīng)激先于肝細(xì)胞凋亡［3］。在培養(yǎng)的肝細(xì)胞里，氧化應(yīng)激產(chǎn)生于乙醇代謝導(dǎo)致的線粒體膜除極和滲透性變化期間。線粒體的這些改變是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵一步。線粒體滲透性改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和半胱天冬酶激活。急慢性飲酒下調(diào)細(xì)胞內(nèi)尤其是線粒體內(nèi)抗氧化水平，易發(fā)細(xì)胞凋亡［4］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，線粒體DNA和核DNA的缺失都能引發(fā)線粒體疾?。?］。自由基引發(fā)線粒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，不飽和脂肪酸破壞，MDA產(chǎn)生增多，導(dǎo)致線粒體膜流動(dòng)性下降，通透性增加［6］。本研究顯示線粒體有明顯的腫脹和斷裂可能與線粒體氧化應(yīng)激、線粒體膜通透性改變有關(guān)。

酒精對(duì)白細(xì)胞介素－6（IL－6）缺陷小鼠有很強(qiáng)的引導(dǎo)MDA產(chǎn)生的作用。IL－6可用于防治酒精導(dǎo)致的肝細(xì)胞活性氧及MDA的產(chǎn)生、線粒體滲透性改變、ATP的損耗［7］。Uzun等用酒精、葡萄糖、精氨酸甲脂分別灌胃大鼠4周后酒精組MDA較葡萄糖組、精氨酸甲脂組極顯著增高，SOD極顯著降低［8］。我們對(duì)急性酒精性肝損傷抗氧化物質(zhì)SOD、MDA的研究與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。Saravanan等在對(duì)照組用酒精處理大鼠60天后，血清肝標(biāo)志酶ALT、GGT、AST、ALP等升高，抗氧化物質(zhì)SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）降低，而實(shí)驗(yàn)組最后30天加用天仙子提取物處理大鼠后，肝標(biāo)志酶顯著降低，SOD、CAT、GPX等顯著升高。天仙子提取物對(duì)酒精性肝損傷自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用［9］?？寡趸?、抗氧化應(yīng)激也是急慢性酒精性肝損傷有效治療的一個(gè)方面。

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