血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在兔腦血管痙攣模型的初步研究

涂建飛，劉一之，紀(jì)建松

自從Zubkov等于2000年首先報道1例因腦血管痙攣死亡患者的基底動脈內(nèi)膜存在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的事實后，人們開始關(guān)注血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）凋亡在痙攣中的臨床作用。而早期腦損傷概念［1-3］的提出，更是引發(fā)了VEC凋亡的研究熱潮。研究發(fā)現(xiàn)，早期腦損傷可能通過細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、缺血機(jī)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障破壞、胞水腫，以至于神經(jīng)元壞死。而早期腦損傷是死亡的重要原因，也是遲發(fā)性功能障礙的重要因素。因此，干預(yù)VEC凋亡成為治療腦血管痙攣的新靶點。然而，對于VEC凋亡的發(fā)生時間、意義則缺乏相關(guān)的研究，本文擬通過電鏡及免疫組化觀察VEC凋亡在腦血管痙攣中不同時間點的表達(dá)，為臨床治療提供理論依據(jù)并開拓新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

35只4～5月齡健康清潔級新西蘭大白兔由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體重2.5～3.5 kg，隨機(jī)分為 12 h、1、2、3、7 d 組，每組 7 只。 每組又分為蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）亞組5只及對照亞組2只 （即導(dǎo)絲僅進(jìn)入但未刺破頸內(nèi)動脈）。出現(xiàn)死亡則給予補(bǔ)充。

1.2 動物模型的制備

采用血管內(nèi)穿刺法制作兔SAH模型。用30%烏來糖（2.0～3.0 ml/kg）溶液靜脈注射麻醉成功后，采用外科方法通過兔股動脈引入0.035英寸超滑導(dǎo)絲和4 F H1導(dǎo)管，將導(dǎo)管插到右側(cè)頸總動脈中上段，常規(guī)行右頸總動脈造影，了解頸內(nèi)動脈起始段血管走行。隨后引入塑形的EXCEL-14微導(dǎo)管（Boston 公司）和 Transend 微導(dǎo)絲（Cordis公司），在路圖狀態(tài)下將導(dǎo)管插到頸內(nèi)動脈。然后引入微導(dǎo)絲硬頭到頸內(nèi)動脈，快速將導(dǎo)絲推出導(dǎo)管約1 cm，重復(fù)1～2次后，退出導(dǎo)絲。最后撤離導(dǎo)管，右股動脈結(jié)扎，皮膚縫合。

1.3 透射電鏡及免疫組化觀察

1.3.1 透射電鏡觀察 12只實驗兔 （SAH亞組10只，對照組2只）分離出右頸內(nèi)動脈，將血管迅速放入預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液固定。常規(guī)丙酮梯度脫水，618環(huán)氧樹脂包埋，行超薄切片后透射電鏡觀察、攝片。

1.3.2 免疫組化觀察 三磷酸脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)記法 （TUNEL）操作按檢測試劑盒 （美國Biovision公司）說明書進(jìn)行。在顯微鏡下觀察拍照。凋亡細(xì)胞的判定：細(xì)胞核固縮、致密、黃色或棕色改變；未凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)色改變。每張玻片在顯微鏡高倍視野下觀察基底動脈 （BA）及后交通動脈（PCoA）的內(nèi)皮細(xì)胞，計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞及正常內(nèi)皮細(xì)胞，用百分?jǐn)?shù)表示，統(tǒng)計凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動物行為學(xué)觀察

各SAH亞組動物術(shù)后第1天表現(xiàn)為嗜睡，活動差，厭食，以術(shù)后12～18 h最重。其中1只實驗兔昏睡2 d。大多數(shù)動物1 d后精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。7 d時同正常組無明顯不同。

2.2 血管痙攣的形態(tài)學(xué)結(jié)果

在各觀察時間點內(nèi)，所有SAH亞組動物PCoA及BA均出現(xiàn)管腔內(nèi)直徑縮小，12 h組最明顯，隨后在第7天再次明顯收縮。而血管壁厚度的增加，則以7 d組最明顯（表1）。

2.3 電鏡表現(xiàn)

SAH亞組血管內(nèi)皮間緊密連接消失，部分內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，空泡化，彈力膜扭曲。平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部份細(xì)胞出現(xiàn)核邊集，核固縮（圖1）。PCoA內(nèi)皮細(xì)胞凋亡動態(tài)變化見圖2。

表1 動物腦血管動態(tài)改變（ ± s）

表1 動物腦血管動態(tài)改變（ ± s）

注：PCoA=后交通動脈，BA=基底動脈

參數(shù) 對照組 12 h組 1 d組 2 d組 3 d組 7 d組PCoA直徑 196.81±10.16 110.88±13.30 159.88±11.61 151.89±16.10 139.98±20.67 139.09±8.56 PCoA管壁 28.45±6.71 32.96±4.24 32.45±7.01 35.18±7.97 34.94±3.71 44.65±8.33 BA直徑 428.72±24.37 206.58±23.32 333.06±23.02 293.40±10.96 338.97±19.37 234.97±16.56 BA管壁 43.39±3.89 51.36±12.35 52.82±7.13 52.04±7.21 50.95±8.31 62.62±5.70

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

PCoA 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率（%）在對照組、12 h、1、2、3、7 d組 凋 亡率 分 別 為 0.01 ± 0.02、0.06 ±0.06、0.26 ± 0.20、0.31 ± 0.12、0.39 ± 0.16、0.29 ±0.07。對照組內(nèi)皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，未見TUNEL陽性細(xì)胞。SAH亞組中，12 h組和7 d組偶見TUNEL陽性細(xì)胞 （圖3、4），1 d組內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞，在3 d組達(dá)到高峰。7 d組較前有所下降。對照組與1、2、3、7 d組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.02）；2 d組和3 d組分別與12 h組和1 d組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。本組平滑肌細(xì)胞可見TUNEL陽性細(xì)胞，與電鏡表現(xiàn)相符。由于多張切片未找到BA血管斷面，未對BA行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1 SAH后2 d，內(nèi)皮細(xì)胞核邊集，凋亡樣改變

圖2 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時間曲線圖

3 討論

細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)機(jī)體生長、發(fā)育及維持機(jī)體細(xì)胞平衡的重要生理機(jī)制。然而，當(dāng)其調(diào)節(jié)紊亂，則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近期研究表明，腦血管疾病特別是缺血性腦血管疾病（包括狹窄與痙攣）的病理損傷程度與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。SAH后痙攣血管壁內(nèi)皮細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，在腦血管痙攣形成機(jī)制中起重要作用［4-6］。本研究擬重點觀察細(xì)胞凋亡的時間窗及意義，為今后深入研究凋亡的價值作一鋪墊。

本實驗發(fā)現(xiàn)SAH后12 h VEC凋亡不明顯，在第1天少量出現(xiàn)，在2～3 d明顯增加，3 d組達(dá)到峰值，7 d組明顯下降。兩種觀察法均支持此點。對于凋亡的出現(xiàn)時間與葉偉等［7］和 Cahill等［8］的研究基本相符，實驗均證實VEC凋亡出現(xiàn)的時間可能在SAH后24 h，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步造成血腦屏障的完整性受到影響，導(dǎo)致腦水腫及細(xì)胞壞死，可能是加重早期腦損害的主要原因。

圖3 SAH后12 h BA內(nèi)皮細(xì)胞無凋亡，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落（HE，× 40）

圖4 SAH后2 d PCoA內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(HE，×100)

對于細(xì)胞凋亡的持續(xù)時間，Cahill等［8］采用大鼠穿刺模型研究24、72 h的血管凋亡情況，雖然血管痙攣持續(xù)72 h，但是發(fā)現(xiàn)凋亡在24 h明顯升高，72 h下降。史煥昌等［9］采用兔注血模型在SAH后72 h檢查發(fā)現(xiàn)VEC凋亡。游鴻海等［10］在二次注血的兔模型上發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡和Cyt-C表達(dá)均在SAH后增多，于第7天達(dá)高峰，第10天逐漸下降。Zubkov等對二次注血的狗模型行血管造影發(fā)現(xiàn)，SAH后3 d開始出現(xiàn)血管痙攣，7 d達(dá)高峰。通過形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，3 d在痙攣血管內(nèi)皮出現(xiàn)凋亡樣細(xì)胞，凋亡程度隨時間加重。這種凋亡時間上的改變，目前認(rèn)為氧合血紅蛋白是細(xì)胞凋亡的主要誘因。血塊中分解出代謝產(chǎn)物（如氧合血紅蛋白）需要一定的時間，而氧合血紅蛋白一般在2 d內(nèi)從外膜穿過血管壁并停留在內(nèi)皮，故本實驗VEC凋亡高峰出現(xiàn)時間遲，在2～3 d達(dá)到高峰。至于細(xì)胞凋亡高峰時間不同的原因可能是：①動物種類的差別。選用不同種屬的動物，可能出現(xiàn)不同的觀察結(jié)果。②制作方法不同。注血法是由于腦池內(nèi)血塊分解出代謝產(chǎn)物，凋亡誘因再作用于血管內(nèi)皮需要一段時間，因而可能表現(xiàn)為凋亡時間延遲。而我們采用血管內(nèi)穿刺法，細(xì)胞因子和血管剪切力等因素均在早期作用于內(nèi)皮，可能使細(xì)胞凋亡峰值提早。我們認(rèn)為二次注血模型雖然在痙攣時間上模擬了人的痙攣時間，但二次注血的凋亡誘因多次作用于內(nèi)皮，可能不能準(zhǔn)確模擬VEC凋亡的時間窗。

通過本組實驗，我們認(rèn)為早期的少量細(xì)胞凋亡可能是細(xì)胞因子等因素直接作用于內(nèi)皮所致，而后期的大量凋亡則是氧合血紅蛋白作用的結(jié)果。在后期，氧合血紅蛋白濃度下降，導(dǎo)致VEC凋亡減少，這可部分解釋本實驗中7 d組VEC凋亡減少的原因。

本實驗亦發(fā)現(xiàn)血管壁的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)均出現(xiàn)凋亡改變。細(xì)胞凋亡以SAH后1、2 d明顯，凋亡峰值時間早于腦血管痙攣，表明凋亡誘因作用于血管壁全程，本實驗中，3、7 d組出現(xiàn)膠原增多，平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生可能與此有關(guān)。Park等的實驗結(jié)果表明，SAH后腦血管痙攣過程中確實有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞凋亡的程度以受累VEC為最重，其次是某些下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞，大腦皮層受累最輕，表明細(xì)胞凋亡在腦血管痙攣的后期亦是重要因素，主要是在遲發(fā)性痙攣的早期階段發(fā)揮作用，主要通過刺激細(xì)胞增生、損傷神經(jīng)元細(xì)胞等方式參與。

細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條［11］，一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase，另一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些caspase的活化可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報道，通過細(xì)胞凋亡的通路抑制細(xì)胞凋亡，雖然不能預(yù)防腦血管痙攣，但能改善臨床癥狀，減輕早期腦損害，上述研究為治療和預(yù)防腦血管痙攣闡釋增加了新的思路［12-15］。

本實驗中，BA多支血管斷面未找到內(nèi)皮細(xì)胞，主要是VEC在受到刺激后容易脫落，其次是TUNEL法的固有缺限，在以后的研究中，可考慮輔以Western印跡技術(shù)檢測ADP核糖多聚合酶（PARP）判斷VEC凋亡，從而提高判斷凋亡的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究在兔腦血管穿刺模型上證實VEC出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，凋亡主要出現(xiàn)在SAH后24 h，本組在3 d達(dá)峰，略早于遲發(fā)性痙攣的峰期，表明VEC凋亡在腦血管痙攣中起重要作用。

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