氨基酸添加對吸水鏈霉菌5008 發酵過程中有效霉素A 合成的影響*

馮勁松，李瑋，劉燕，熱米拉，周文文，鄭曉冬

(浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州，310058)

有效霉素A(Validamycin A)又被稱作井岡霉素，是一種安全高效的抗真菌抗生素。目前在我國以及東南亞各主要糧食產區，有效霉素A 作為一種優質農藥在防治水稻、玉米以及小麥紋枯病方面取得了顯著的成效［1］。另外，作為合成抗糖尿病臨床藥物阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的重要原料，有效霉素A 的發酵生產在醫藥領域也受到了廣泛關注［2］。目前工業化發酵采用的菌株是上海農藥所報道的吸水鏈霉菌5008 變種(Streptomyces hygroscopicus 5008)，盡管自70 年代開始該菌株使用已有近40 年，但其代謝產物有效霉素A 仍是最為有效、應用面積最廣的農用抗生素。現階段我國的年需求量超過6萬t，年產值超5 億元［3－4］。因此如何提高有效霉素A 產量，降低其生產成本仍是當前研究的熱點問題。

氨基酸作為重要的生物小分子，在微生物發酵過程中對菌體生長以及抗生素合成起著關鍵性作用。作為抗生素合成的前體物質，氨基酸可以直接參與到抗生素合成途徑中參與合成反應;氨基酸或其功能肽結構可以作為抗生素合成過程的激活劑或抑制劑對代謝途徑中關鍵酶的活力進行調節;作為氮源，培養基中氨基酸的種類與含量也會影響菌體的生長速率;而作為兩性小分子，氨基酸的水解產物會造成培養基中pH 波動，改變微生物的生長環境。

在發酵過程中添加氨基酸促進發酵產量的方法已在很多微生物中進行了應用［5－8］。Cheng 等［9］發現在培養基中添加氨基酸會對鏈霉菌生長以及次級代謝產物合成有著顯著的影響。在吸水鏈霉菌5008的發酵過程中，其次級代謝物-有效霉素A 的合成會受多方面因素的影響［10－11］。汪世山等［12］利用響應面實驗證實以黃豆餅粉作為氮源時，有效霉素A 產量會顯著提高。隨后Wei 等［13］進一步驗證了氮源的種類與含量對有效霉素A 產量影響的作用。有效霉素A 作為氨基糖苷類抗生素，其生物合成必定需要結合氮源提供的氨基以完成結構轉化，所以氨基酸對其生物合成尤為重要，但目前對氨基酸影響有效霉素A 生物合成的研究十分有限。本實驗通過在搖瓶中添加9 種不同種類的氨基酸，研究其對有效霉素A發酵過程的影響，以便系統地闡述氨基酸對吸水鏈霉菌5008 生長及代謝產物積累的作用，為深入研究有效霉素A 合成過程中氨基的來源提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

實驗菌種為吸水鏈霉菌5008(S. hygroscopicus 5008)，孢子懸浮于25%甘油中，－20℃保存。

產孢平板培養基(SFM)(g/L):黃豆餅粉20、甘露醇20、瓊脂20。

種子培養基(g/L):玉米粉30、黃豆餅粉22、酵母提取物10、NaCl 2、KH2PO40.8。

發酵培養基(g/L):玉米粉100、黃豆餅粉25、酵母提取物5、NaCl 1、KH2PO41.5。

1.2 培養方法

種子培養:在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 種子培養基，121℃滅菌20 min。在超凈工作臺中，接種0.1 mL 孢子懸浮液。培養溫度37℃，轉速220 r/min，培養時間1d。

發酵培養:在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 發酵培養基，121℃滅菌20 min。在超凈工作臺中，接種5 mL 種子培養液。在接種12 h 后，在超凈臺中將滅菌好的氨基酸按照1、10、100 mmol/L 的終濃度加入到發酵培養基中。每隔24 h，用滅菌槍頭對同一發酵條件下的3 個搖瓶進行取樣，每次吸取2 mL 培養液于離心管中用于后續檢測。培養溫度37℃，轉速220 r/min，培養時間5d。

1.3 分析方法

1.3.1 有效霉素A 產量測定

本研究結合相關文章報道，以0 ～20 g/L 濃度范圍的有效霉素A 純品溶液制作標準曲線，采用高效液相色譜法(HPLC)測定有效霉素A 產量［11］。

吸取2 mL 發酵液于離心管，10 000 g 離心5 min，吸取0.5 mL 上清液于新離心管。加入0.5 mL氯仿，劇烈振蕩直至形成乳濁液。將乳濁液常溫靜置15 min，12 000 g 離心5 min。上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，待測。配制液相磷酸鹽溶液:吸取7.8 g/L的NaH2PO4·2H2O 溶液51 mL，吸取17.9 g/L 的Na2HPO4·12H2O 溶液49 mL，去離子水定容到1 000 mL，調節pH 到7.0。溶液用0.22 μm 濾膜抽濾后超聲30 min，待用。色譜柱采用Elite Hypersil ODS2 C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為210 nm，流動相為98%的磷酸鹽緩沖液與2%的甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為35℃，出峰時間約為8 min。

1.3.2 菌體生長量測定

由于發酵培養基中用作營養物質的玉米粉和黃豆餅粉都是實際生產中使用的固體顆粒材料，所以常規的干重法并不能準確反映菌體生長的情況。本實驗采用Bradford 法測量細菌裂解后的蛋白量來反映菌體生長［11－14］。

1.3.3 殘糖含量測定

通過計算培養基中各組分的含糖量(玉米粉82.92%，黃豆餅粉24.57%，酵母粉25.89%)，得出培養基的初始糖濃度為90.35 g/L，并采用苯酚-濃硫酸法測定殘糖含量［10］，以反映培養基中總糖利用情況。

1.3.4 三磷酸甘油醛脫氫酶( GAPDH) 與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶( G6PD) 活力測定

G6PD 的測定方法參照Lee 的報道并進行修改［15］。GAPDH 的測定方法參照Ralser 和Griffiths 的報道［11，16］。

以上數據均是取自3 個獨立樣本的平均值，在SPSS 軟件中采用獨立樣品t 檢驗對數據的差異性進行分析，如果P值小于0.05，差異被認為是顯著的。

2 結果與討論

2.1 氨基酸最適添加濃度篩選及其對有效霉素A產量的影響

不同種類、不同添加量的氨基酸添加發酵實驗結果如圖1 所示。

圖1 不同氨基酸添加量對有效霉素產量的影響Fig.1 Effect of additive amounts of different amino acids on Val-A production

圖1 結果表明，所有氨基酸添加發酵實驗中，當氨基酸添加濃度只有1 mmol/L 時，與對照組相比，有效霉素A 產量受到的影響有限;而當氨基酸添加濃度達到10 mmol/L 時，除去半胱氨酸與甲硫氨酸添加組，其余組中有效霉素A 產量都有明顯的上升;當氨基酸添加濃度提高至100 mmol/L，發酵產量并未有更為明顯的升高，這說明10 mmol/L 的氨基酸濃度是促進有效霉素A 產量的閾值濃度，并且從成本角度考慮也認為10 mmol/L 是氨基酸添加發酵策略的最適添加濃度。這一現象與Stirrett［8］和Bouras［17］的研究結果類似，他們發現添加氨基酸對抗生素產量的提升作用存在最適濃度，當添加量超過這一濃度時，次級代謝產物產量并不會再有顯著提升。隨后在最適添加濃度下，對氨基酸影響有效霉素A 產量的結果進行分類分析。

在測試的氨基酸中，精氨酸和賴氨酸為堿性。氨基酸;天冬氨酸和谷氨酸為酸性氨基酸;半胱氨酸為極性中性氨基酸;亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和蛋氨酸均為非極性中性氨基酸。由表1 可知，9 種氨基酸中僅有半胱氨酸對有效霉素產量沒有影響，其他8 種氨基酸均有顯著影響。除甲硫氨酸對有效霉素A 合成表現出較強的抑制作用，其余7 種氨基酸均表現出顯著的促進作用。其中異亮氨酸與亮氨酸對產量提升促進作用最大，與對照相比，分別使有效霉素A 產量提高了48%和43%。根據氨基酸的酸堿性對有效霉素A 產量影響進行分類分析，結果顯示中性氨基酸效果最優，其次為酸性氨基酸，堿性氨基酸效果最差。根據Jin 等［18］報道，當發酵環境中pH 較低時會降低有效霉素A 的終產量，但我們通過添加強酸弱堿鹽和強堿弱酸鹽調節發酵過程中pH 模擬該報道結論，最終產量結果并未顯示出與氨基酸添加實驗相同的效果，而且氨基酸添加實驗中2 種含硫的中性氨基酸，甲硫氨酸與半胱氨酸也未對有效霉素A 產量產生促進作用，所以推測氨基酸引起的pH 變化并不是影響有效霉素A 產量的唯一因素。

表1 不同種類氨基酸對有效霉素產量的影響Table 1 Effect of different kinds of amino acids on Val-A production

2.2 氨基酸對菌體生長和糖利用的影響

在抗生素發酵過程中加入前體氮源物質提高發酵效價的報道中，代煥梅等［19］發現添加絲氨酸會促進菌體生長并提高寧南霉素產量;胡景等［20］發現在添加氨基酸之后，阿維菌素的產量會隨著菌體生長的促進而得到提高。在確定了氨基酸的最適添加濃度和其對產量影響作用后，我們對10 mmol/L 添加濃度下不同種類氨基酸對菌體生長和糖利用的影響進行考察，如表2 所示，盡管氨基酸會對有效霉素A 產量產生影響，但是與對照組相比，所有氨基酸添加組中鏈霉菌生物量積累并無顯著差異，且整個過程中糖利用也未呈現顯著變化。由此可見，氨基酸添加對有效霉素A 產量的提升作用，不是通過增加細胞量或提高糖利用率實現的，而是通過調節胞內碳源流向，促進單位細胞中有效霉素A 的合成效率，進而實現了對有效霉素A 產量的提升作用。

表2 不同種類氨基酸對蛋白積累和糖利用的影響Table 2 Effect of different kinds of amino acids on protein accumulation and sugar utilization

2.3 氨基酸對菌體碳代謝的影響

曾有報道指出［21］在酵母發酵過程中經過脫氨作用的氨基酸碳骨架可經特定的分解代謝途徑直接進入三羧酸循環(TCA)，導致碳代謝流在3-磷酸甘油醛節點處發生轉移，進而影響次級代謝。由圖2 所示，在吸水鏈霉菌5008 中，磷酸戊糖途徑(PPP)是合成有效霉素A 前體物質7-磷酸景天庚酮糖的主要代謝途徑，作為限速酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的活力直接影響磷酸戊糖途徑中有效霉素A 前體的積累量。此外，糖酵解途徑(EMP)作為胞內主要供能途徑與PPP 途徑對碳源存在著競爭關系，三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是催化EMP 途徑中關鍵反應的限速酶，因此其活力不僅會直接影響菌體生長也會間接影響有效霉素A 前體的合成。我們選定對有效霉A 素產量有明顯影響作用的異亮氨酸與甲硫氨酸發酵組，對其碳代謝途徑中關鍵酶活力進行了檢測，以反映氨基酸對碳代謝的影響。

圖2 碳代謝與有效霉素A 合成的關系Fig. 2 Relationship between carbon metabolism and Val-A biosynthesis

由圖3a 所示，異亮氨酸組中，G6PD 活力在發酵初期就呈現出明顯的升高，在24 h，酶活力提高了41%，在48 h，酶活力也有24%的提高。而甲硫氨酸組卻在48 h 使G6PD 活力抑制了11%。當發酵進入穩定期后，菌體生長停滯，所有發酵組中G6PD 活力大幅度下降，與對照相比不再有差異。與G6PD 相比，作為主要供能途徑的限速酶，GAPDH 在整個生長周期中都保持著較高的活性。由圖3b 所示，氨基酸添加對GAPDH 活力影響不大。在菌體生長前期，GAPDH 活力并沒有展現出與對照組的區別。但是當菌體生長到48 h 向穩定期過渡階段，異亮氨酸組中GAPDH 活力開始下降，到72 h，異亮氨酸組中GAPDH 活力受到明顯抑制，與對照組相比其活力降低了13%，到96 h，抑制解除，所有組中GADPH 活力一致。

結合2 種酶活力變化的結果分析，異亮氨酸在發酵初期就對PPP 途徑有明顯的促進作用，但在對數生長階段并沒有抑制EMP 途徑，所以菌體生長沒有受到影響，當進入穩定期，菌體內次級代謝逐漸增強，在這一階段異亮氨酸抑制了EMP 途徑的活力，使碳代謝從EMP 途徑流向PPP 途徑，促進了有效霉素A前體的轉化，提高了有效霉素A 生物合成的效率。而甲硫氨酸在發酵初期便對PPP 途徑有明顯的抑制作用，但在整個發酵周期中對EMP 途徑的活力并沒有影響，其通過抑制有效霉素A 合成前體的積累，降低了有效霉素A 的產量。由此推測，氨基酸都是通過調節碳代謝途徑中關鍵酶活力，影響有效霉素A合成前體7-磷酸景天庚酮糖的積累量，從而造成對有效霉素A 生物合成的影響作用(包括異亮氨酸的促進作用與甲硫氨酸的抑制作用)。

圖3 氨基酸對碳代謝途徑的影響Fig.3 Effect of amino acids on carbon metabolic pathway

3 結論

本研究將不同種類氨基酸添加到吸水鏈霉菌5008 發酵過程中并對其影響進行檢測，進一步探索了氮源種類和含量對有效霉素A 產量的影響作用，通過篩選氨基酸添加量，發現氨基酸添加的最適閾值濃度，根據氨基酸的酸堿性，將其影響進行分類分析，在添加氨基酸的發酵實驗中，除去半胱氨酸與甲硫氨酸，其余各組都展現了對有效霉素A 產量顯著的促進作用。雖然中性氨基酸會優于酸性與堿性氨基酸，但是2 種含硫的中性氨基酸-半胱氨酸與甲硫氨酸并沒有提高有效霉素A 的產量，說明氨基酸引起的pH變化并不是導致有效霉素A 產量提高的原因。隨后為了進一步探索氨基酸的影響作用，對菌體生長和糖利用情況進行了檢測，結合對碳代謝關鍵酶活力的分析，發現氨基酸是通過調節碳代謝途徑的活力，實現了碳源從糖酵解途徑到磷酸戊糖途徑代謝流向的變化，從而造成了有效霉素A 前體積累量的改變，影響有效霉素A 的生物合成。此外在有效霉素A 合成過程中，氮的來源尚不清楚，因而氨基酸還可能以氨基氮形式存在，直接參與到次級代謝產物的合成反應中，促進有效霉素A 產量的提高。實驗中發現2 種含硫氨基酸對有效霉素A 合成并無促進作用，且甲硫氨酸還會顯著降低有效霉素A 的產量，這與氨基酸所攜帶基團有著密切關聯，還需要進一步實驗加以證實。

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