球形節桿菌C224 分批發酵2-酮基-D-葡萄糖酸的條件優化及其動力學模型的構建*

孫文敬，高培玲，魏轉，崔鳳杰，，周延政，滕文華，劉敬澤

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江，212013)

2(河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊，050016)

3(百勤異VC 鈉有限公司，江西 上饒，334221)

4(河北化工醫藥職業技術學院 制藥工程系，河北 石家莊，050026)

2-酮 基-D-葡 萄 糖 酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)可以作為除莠化合物的生產原料，也可作為糠醛、D-阿拉伯糖、D-核糖、D-異抗壞血酸及其鹽類的合成前體，還是飼料添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑的促凈劑和照片顯影劑的重要組分［1］，但其最主要的用途則是在食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類的合成方面［2－3］。我國是目前國際上最大的D-異抗壞血酸(鹽)生產國，年產量接近40 000 t，占有該產品80%以上的國際市場份額。

相對于化學催化合成［4］、酶促合成［5－7］等其它生產方法，發酵法是目前最經濟、最高效的2KGA 生產方法［1］，因而在工業生產中得到了普遍采用。國內外2KGA 工業生產通常采用補料分批發酵模式，其發酵液中的產物濃度大、轉化率高，但生產強度較低，一般不會超過6.0 g/(L·h)，限制了設備利用率的提高與能源消耗的減少［2］。因此，對2KGA 發酵條件及發酵生產模式進行優化是十分必要的。

有關2KGA 發酵條件的研究已有較多報道［8－10］，但幾乎未涉及國內主要工業用菌之一的球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)，尤其是在通氣量與葡萄糖濃度對2KGA 發酵的影響方面。另外，發酵動力學的研究對發酵工藝的優化和發酵生產模式的選擇具有具有重要的指導意義，但目前尚未見到有關球形節桿菌發酵生產2KGA 動力學研究的報道。

在初步考察葡萄糖濃度與溶解氧對2KGA 發酵影響的基礎上，本研究試圖構建能夠揭示球形節桿菌2KGA 分批發酵代謝基本特征的動力學模型，為發酵工藝和發酵生產模式的優化提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株

球形節桿菌C224，是以K1022 菌株為親株經紫外誘變選育的2-酮基-D-葡萄糖酸高產菌株［11］，對噬菌體KS211、KS212、KS213 和KSL －1［12］具有穩定的抗性。

1.2 培養基

斜面培養基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。

菌種擴大培養基(g/L):葡萄糖20.0，玉米漿10.0，尿素2.0，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.0。

發酵培養基(g/L):大米淀粉水解糖(以無水葡萄糖計)162.0，玉米漿15.0，pH 6.7。大米淀粉水解糖由江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司提供，其葡萄糖質量濃度約為265.0 g/L，蛋白質2.06 g/L(總氮 × 6.38)。

1.3 發酵裝置

鎮江格瑞生物工程有限公司制造的GRJ-50D 全自動機械攪拌發酵系統，包括1 臺5L 的菌種擴大培養設備和1 臺50L 的自控不銹鋼發酵罐，該發酵系統具有自動控溫、無級調速、測定培養液溶解氧濃度和pH 值等功能。

1.4 培養條件

1.4.1 斜面菌種培養［2］

將活化的保藏菌種接種至斜面培養基上，30 ℃培養24 h。

1.4.2 搖瓶種子培養［2］

將斜面菌種的菌懸液接入裝有50 mL 種子培養基的500 mL 錐形瓶中，30℃、260 r/min 旋轉式搖床振蕩培養20 h。

1.4.3 種子擴大培養

按2.0%(體積分數)的接種量將搖瓶種子接入3.5 L 的菌種擴大培養基中，在罐溫30℃、罐壓0.03 MPa、通氣量105.0 L/h 和轉速400 r/min 的條件下培養。當培養液中的菌體細胞濃度達到6.15 g/L 左右時，接入發酵培養基中。

1.4.4 發酵

按10.0%(體積分數)的接種量將液體種子接入35.0 L 的發酵培養基中，在罐溫32 ±2 ℃、罐壓0.03 MPa、通氣量52.5 L/min(發酵過程中最低溶解氧濃度不低于4.0%)、轉速450 r/min 的條件下進行分批發酵。發酵過程中，當發酵液的pH 值低于5.4 時，采用200.0 g/L 的Na2CO3溶液作為中和劑，維持發酵液的pH 值在5.6 ±0.2。

1.5 測定方法

1.5.1 種子培養液和發酵液中菌體細胞濃度的測定

采用比濁法測定［2］。25℃的條件下，用新制蒸餾水稀釋種子培養液或發酵液20 倍，以水作空白，用分光光度計測定其在650 nm 處的吸光度，并根據細胞干質量與吸光度的線性關系求得菌體細胞濃度(每升發酵液中的細胞干質量)。本實驗條件下，OD650nm=1 時細胞濃度為0.44 g/L。

1.5.2 發酵液中2KGA 的測定

采用高效液相色譜法測定［1］。

高效液相色譜儀的型號:1260 Infinity(美國Agilent 公司)。

色譜條件:色譜柱為Hypersil SAX 強陰離子交換色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為pH 3.0的0.1 mol/L KH2PO4溶液;流速為1.0 mL/min;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為216 nm;柱溫30℃;進樣量為50 μL。

1.5.3 葡萄糖的測定

采用SBA-40 型生物傳感分析儀測定［2］。

2 結果與分析

2.1 通氣量對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵的影響

工業生產條件下，通氣量與攪拌速率是影響發酵體系中溶解氧濃度的最主要的因素。根據生產經驗，無論是采用氣升式還是機械攪拌式發酵罐，國內2KGA 工業發酵過程中的最大通氣量為1.0 v·v－1·m－1，其糖酸轉化率可以達到0.94 g/g(為理論產率的87.0%)以上，接近于實驗室發酵水平，一般認為該通氣條件是合適的，忽視了通氣量對發酵生產強度的影響。2KGA 發酵是一個典型的生物氧化過程，維持細胞的生長代謝需要大量的氧氣，因此實驗設計通過增加通氣量來提高2KGA 的生產強度。研究結果(表1)表明，隨著通氣量的提高，細胞濃度明顯增加，發酵周期顯著縮短，生產強度大大增強，2KGA 的產量和糖酸轉化率有所增加。當通氣量超過1.5 v·v－1·m－1時，發酵過程中的最小溶解氧濃度明顯加大，但各項實驗指標無顯著變化。因此，可以認為本實驗條件下發酵的通氣量以不低于1.5 v·v－1·m－1為宜。

在通氣量為1.5 v·v－1·m－1的條件下，發酵過程中溶解氧的變化如圖1 所示。從圖中可以看出，發酵的前3 h，發酵液中的溶解氧濃度迅速降低;至4 h時，溶解氧濃度達到最低，只有4.0%左右;4 ～20 h之間，溶解氧濃度緩慢增加，至20 h 時達到20.0%左右;20 h 后，溶解氧濃度迅速回升，發酵接近終點(24 h)時溶解氧濃度達到73.0%以上。

表1 通氣量對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵的影響Table 1 Effect of aeration rate on the 2KGA fermentation performance by Ar. globiformis C224

圖1 球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵過程中溶解氧濃度的變化Fig.1 Profile of dissolved oxygen during 2KGA production by Ar. globiformis C224

2.2 葡萄糖濃度對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵的影響

在2KGA 發酵過程中，碳氮比偏大或偏小均不利于菌體產酸［8］。因此，本實驗保持大米淀粉水解糖與玉米漿的比例不變，通過改變發酵培養基中的葡萄糖濃度，考察其對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵的影響。研究結果(表2)表明，葡萄糖濃度低于150.0 g/L 時，隨著葡萄糖濃度的提高，發酵液中的最大細胞濃度、生產強度、2KGA 產量和糖酸轉化率逐步增大，發酵周期逐步延長;葡萄糖濃度在120.0～180.0 g/L 時，發酵生產強度和糖酸轉化率基本穩定，分別保持在6.36 g/(L·h)和0.96 g/g(約為理論產率的88.75%)以上;葡萄糖濃度達到210.0 g/L時，發酵生產強度和糖酸轉化率分別只有5.41 g/(L·h)和0.87 g/g。因此，球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵培養基的葡萄糖濃度以120.0 ～180.0 g/L 為宜。

表2 葡萄糖濃度對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵的影響Table 2 Effect of initial glucose concentration on the 2KGA fermentation performance by Ar. globiformis C224

2.3 球形節桿菌C224 菌株的2KGA 發酵過程

在初始葡萄糖濃度為162.0 g/L、通氣量為1.5 v·v－1·m－1的條件下進行發酵。定時取樣測定發酵液中的細胞濃度、葡萄糖濃度和發酵產物2KGA 的濃度，并計算細胞生產強度、葡萄糖消耗速率和發酵生產強度，繪制球形節桿菌C224 菌株的2KGA 發酵過程曲線(圖2)。

從圖2 可以看出，球形節桿菌C224 菌體細胞的生長幾乎沒有延滯期，很快進入對數生長期(0 ～2 h的細胞生產強度約為0.22 g/(L·h)，4 h 時細胞濃度就已達到2.51 g/L 左右，發酵2 ～4 h 的細胞生產強度最高［約為0.64 g/(L·h)］;4 ～16 h，細胞濃度的增幅急劇減緩，其生產強度只有0.06 g/(L·h)左右;16 h 后，細胞生長進入穩定期并持續至發酵達到終點。從圖2 還可看出，葡萄糖消耗與2KGA 積累的變化趨勢一致。在細胞生長的對數期內，盡管葡萄糖的消耗速率和2KGA 生產強度相對較低，但仍然分別達到4.00 g/(L·h)和2.71 g/(L·h)(發酵2 h);8～16 h 是2KGA 的高速合成期，葡萄糖的消耗速率達到7.10 g/(L·h)左右，2KGA 的生產強度達到7.50 g/(L·h)左右，幾乎所有被消耗的葡萄糖按理論產率轉化為2KGA;16 h 后，葡萄糖消耗速率與2KGA生產強度明顯降低。

根據上述研究結果，可以將球形節桿菌C224 的2KGA 發酵過程分為2 個階段:第1 階段，菌體處于對數生長期，同時將所消耗的葡萄糖部分轉化為2KGA;第2 階段，菌體生長處于穩定期，2KGA 持續高速合成至葡萄糖消耗殆盡，所消耗的葡萄糖幾乎被完全轉化為2KGA，由此可以初步推定球形節桿菌C224 生產2KGA 的發酵過程為部分生長聯系型。

圖2 球形節桿菌C224 菌株分批發酵生產2KGA 的過程Fig. 2 Time course of 2KGA batch fermentation by Ar. globiformis C224

2.4 球形節桿菌C224 菌株分批發酵生產2KGA 動力學模型的構建

2.4.1 菌體生長動力學模型

能夠描述菌體生長動力學的模型很多，但以Monod 和Logistic 方程最為常用［13］。從圖2 可以發現，4 h 時菌體細胞濃度就已達到發酵過程中最高細胞濃度的75%以上，隨后細胞生長趨緩，在發酵后期細胞濃度達到最大值。因此，以Logistic 方程［14］來描述球形節桿菌C224 的生長規律較為合適，即:

當t=0 時，X=X0，對式(1)進行積分可得代數方程(2):

將圖2 的實驗數據應用于上述模型，利用Origin 8.0 對菌體生長動力學模型參數進行求解，結果為:X0=0.70 g/L;Xm=3.16 g/L;μm=0.54 h－1。對菌體生長的實驗數據與模型計算值進行比較，其平均相對偏差計算為5.27 %(圖3)。

圖3 菌體生長實驗值和模型計算值的比較Fig.3 Comparison between experimental data and predictive values of cell growth model

從非線性擬合出的生長曲線中可以看出，菌體生長幾乎沒有延滯期，細胞濃度的增幅隨發酵時間的推移逐漸減緩，且在發酵的中后期細胞濃度達到最大值。另外，從圖3 中還可以看出，模型計算值和實驗值擬合效果良好，模型的相關系數R2=0.951 4，說明所選擇的模型能夠較好地反映球形節桿菌C224 的生長規律。

2.4.2 產物形成動力學模型

根據發酵過程中產物形成與底物利用之間的關系，發酵產物形成的過程可被分為3 類:生長聯系型(簡單發酵型)、部分生長聯系型(中間發酵型)和非生長聯系型(復雜發酵型)［15］。

利用經典的Luedeking-Piret 方程［16］描述產物形成與細胞生長之間的關系，其數學表達式為:

當a≠0，b=0 時，產物形成為生長聯系型;當a=0，b≠0 時，產物形成為非生長聯系型;當a≠0，b≠0 時，產物形成為部分生長聯系型;

將式(1)代入式(3)，得:

積分后得:

其中

將μm、X0、Xm和圖2 的實驗數據應用于上述模型，利用Origin 8.0 對產物合成動力學模型參數進行求解，結果為:a=3.62;b=2.29。計算結果表明，球形節桿菌C224 菌株2KGA 的合成屬于部分生長聯系型。對2KGA 合成的實驗數據與模型計算值進行比較，其平均相對偏差計算為5.73%(圖4)。

圖4 2KGA 產量實驗值和模型計算值的比較Fig.4 Comparison between experimental data and predictive values of 2KGA production model

從圖4 中可以看出，實驗數據與模型計算值模型的擬合效果很好，模型的相關系數R2=0.995 4，說明所選擇的模型能夠比較準確地反映球形節桿菌C224菌株2KGA 的合成規律。

2.4.3 底物消耗動力學模型

常見的底物消耗動力學模型是基于底物消耗的物料衡算而建立的方程式。在發酵過程中，底物一部分消耗用于菌體的生長和維持細胞生命活動，一部分用于形成產物［13］。因此，底物消耗速率可表示如下:

將式(1)和式(3)帶入，積分得

將μm、X0、Xm和圖2 的實驗數據應用于上述模型，利用Origin 8.0 對底物消耗動力學模型參數進行求解，結果為:c=6.34;d=2.01;Yx/s=0.340 5 g/g;Yp/s=1.062 6 g/g。對葡萄糖消耗的實驗數據與模型計算值進行比較，其平均相對偏差計算為4.34%，結果如圖5 所示。從圖中可以看出，實驗數據和模型計算值擬合效果很好，模型的相關系數R2=0.994 7，說明所選擇的模型能夠比較準確地反映了葡萄糖的消耗規律。

3 結論

圖5 殘糖實驗值和模型計算值的比較Fig.5 Comparison between experimental data and predictive values of glucose consumption model

通氣量和葡萄糖濃度對球形節桿菌C224 菌株2KGA 發酵均有明顯影響，通氣量以不低于1.5 v·v－1·m－1為宜，葡萄糖濃度以120.0 ～180.0 g/L 為宜。在適宜的發酵條件下，球形節桿菌C224 菌株分批發酵生產2-酮基-D-葡萄糖酸的生產強度可達6.36 g/(L·h)以上，糖酸轉化率不低于0.96 g/g(約為理論產率的88.75%)。

構建的發酵動力學模型能夠比較準確地反映球形節桿菌C224 菌體生長、2KGA 合成與葡萄糖消耗的規律，有助于進一步了解該發酵菌種的生理特性和特征、菌種生長和目的產物積累的適宜條件以及各種發酵參數之間的關系，對發酵工藝優化、過程控制及設備放大具有具有重要的指導意義。

符號說明

X—菌體濃度( g/L) ;t—發酵時間( h) ;X0—起始菌體濃度( g/L) ;Xm—最大菌體濃度( g/L) ; μm—最大比生長速率( h－1) ;S—葡萄糖濃度( g/L) ;S0—起始葡萄糖濃度( g/L) ;a，

b—與菌體生長量相關聯的產物合成常數;ms—細胞維持系數［g/( g·s) ］;P—2KGA 濃度( g/L) ;Yx/s—菌體對葡萄糖的得率系數( g/g) ;Yp/s—2KGA 對葡萄糖的得率系數( g/g) 。

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